Murin Beyninden Tümör İçeren Bağışıklık Hücrelerinin İzole Edilmesi

Özet

Kaynak: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Glioma İnfiltre Eden Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İzolasyonu ve Akış Sitometrik Analizi. J. Vis. Uzm. (2015)

Video, tümöre sızan periferik kan mononükleer hücrelerinin mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak bir fare beyninden izolasyonunu göstermektedir. Bunu, daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplamak için yoğunluk gradyan santrifüjlemesi takip eder.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Steril bir plastik kapta 264 ml ultra saf deiyonize suya (3,93x) 90 ml 10x PBS yerleştirerek yoğunluk santrifüjleme ortamı karışım solüsyonu hazırlayın. HCl ile pH 7.0-7.2'ye titre edin ve 0.22 μm'lik bir filtreden filtre ile sterilize edin. 4 °C'de saklayın.

50 ml'lik bir polipropilen santrifüj tüpünde 18 ml yoğunluk santrifüj ortamı karışım çözeltisini 30 ml yoğunluk santrifüjleme ortamı (ayrıntılar için malzeme listesine bakın) ile birleştirerek %70 yoğunluklu santrifüj ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın, ancak kullanmadan önce RT'ye getirin.

50 ml'lik bir santrifüj tüpünde 9,6 ml DPBS ile 10,4 ml %70 yoğunluklu santrifüj ortamını birleştirerek %37 yoğunluklu santrifüj ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın, ancak kullanmadan önce RT'ye getirin.

1. Glioma sızan PBMC'lerin izolasyonu

1. Temiz, tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak, iki yarım küreyi ikiye bölmek için beynin merkezini sagital bir kesim yaparak beynin tümörü içeren bölgesini izole edin. İpsilateral hemisfer medial tarafını aşağı çevirin ve tümör implantını içeren hedef dokuyu izole etmek için beyincik ve koku soğancağı seviyelerinde iki koronal kesi yapın (Şekil 1A). Kontralateral hemisferin eşdeğer bir kısmı da izole edilebilir ve negatif kontrol olarak kullanılabilir.
2. Hedef dokuyu 1 ml DPBS içeren sırasıyla etiketlenmiş cam Dounce doku öğütücüsüne yerleştirin, pistonu tamamen aşağı itin ve başlangıçta dokuyu bozmak için 7 kez çevirin. Sıvının doku öğütücünün dibine geri çökmesini sağlamak için pistonu kaldırın. Bu adımı üç kez tekrarlayın; Bununla birlikte, dokunun aşırı gerilmesini önlemek için pistonu sonraki iki tekrar sırasında yalnızca 4 kez ve son tekrar sırasında 3 kez çevirin.
3. Bir P-1000 mikropipet kullanarak, doku öğütücüye durulamak için pistonun kenarları boyunca sırayla üç adet 1 ml hacimde buz gibi DPBS uygulayın.
4. Öğütülmüş beyin maddesini yukarı ve aşağı pipetleyerek ve buz üzerinde etiketli 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirerek yeniden süspanse edin. Dounce doku öğütücünün kenarlarını 1 ml ilave buz gibi soğuk DPBS ile durulayın ve aynı 15 ml'lik santrifüj tüpüne ekleyin. Tüm numuneler işlenene kadar ezilmiş beyin maddesi içeren tüm tüpleri buz üzerinde tutun.
5. Tüm numuneler işlendikten sonra, öğütülmüş beyin maddesini 15 ml'lik santrifüj tüplerinde 740 x g'da (maks. RCF) 4 ° C'de 20 dakika boyunca döndürün.
6. Süpernatanı 10 ml'lik bir serolojik pipet ve pipet tabancası ile çıkarın ve peletlenmiş beyin maddesini bir P-1000 kullanarak önceden hazırlanmış kollajenaz / DNaz-I sindirim enzimlerinin 1 ml'sinde yeniden süspanse edin. 15 ml'lik santrifüj tüplerini bir test tüpü rafına yerleştirin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
7. Doku ayrışmasını kolaylaştırmak için tüpleri hafifçe vurarak inkübasyon süresi boyunca numuneleri iki kez hafifçe çalkalayın.
8. Sindirim enzimlerini seyreltmek için her tüpe 10 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak 6 ml buz gibi DPBS ekleyin. Yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin ve toplam hacimleri steril 70 μm naylon ağ filtrelerden buz üzerinde yeni etiketli 15 ml'lik santrifüj tüplerine süzün.
9. Tek hücreli bir pelet elde etmek için beyin hücresi süspansiyonunu 4 ° C'de 20 dakika boyunca 740 x g'da (maksimum RCF) aşağı çevirin (Şekil 1B). 15 ml'lik tüpleri santrifüjden çıkardıktan sonra, buzun üzerine yerleştirin ve bir sonraki adıma hazırlık olarak santrifüj üzerindeki sıcaklık ayarını yaklaşık 21 °C'ye yükseltin.
10. Süpernatanı beyin hücreleri içeren her tüpten tamamen çıkarın ve başlangıçta peletleri bir P-1000 mikropipet kullanarak 1 ml% 70 yoğunluklu santrifüj ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra 10 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak her tüpe 4 mililitre daha %70 yoğunluklu santrifüj ortamı ekleyin. Kapakları güvenli bir şekilde vidalayın ve tüplere birkaç kez nazikçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu homojenize edin.
11. % 70 yoğunluklu santrifüj ortamında yeniden süspanse edilmiş beyin hücrelerini içeren 15 ml'lik santrifüj tüplerini buzdan çıkarın ve RT'de bir test tüpü rafına yerleştirin. Her seferinde bir tane, iki yoğunluklu santrifüj ortamı katmanı arasında temiz bir arayüz oluşturmak için bir P-1000 mikropipet ile 5 ml %70 yoğunluklu santrifüj ortamı çözeltisine 2 ml %37 yoğunluklu santrifüj ortamı çözeltisini dikkatlice yerleştirin (Şekil 1C).
    1. Arayüzün konumunu belirtmek için ince uçlu bir işaretleyici kullanın, böylece santrifüjlemeden sonra ayrım daha az belirgin hale geldiğinde kolayca tanımlanabilir.
12. Arayüzün bozulmasını önlemek için 15 ml'lik santrifüj tüplerini 740 x g'da (maks. RCF) RT'de 20 dakika boyunca ara vermeden döndürün.
13. Santrifüjlemeden sonra, iki yoğunluklu santrifüj ortamı katmanı arasındaki arayüzde biriken PBMC'leri toplayın (Şekil 1D), lipit tabakasını dikkatlice atlayarak, yan tarafındaki tüpe bir P-200 mikropipeti sokarak.
    1. PBMC bandı seviyesine geldikten sonra, %70 yoğunluklu santrifüj ortamı katmanının yüzeyinden 200 μl'yi yavaşça çıkarın ve buz üzerinde sırasıyla etiketlenmiş bir polipropilen FACS tüpüne yerleştirin. Numune başına toplam 400 μl hacim için bir kez tekrarlayın.
14. Yoğunluk santrifüjleme ortamını yeterince seyreltmek için 400 μl PBMC içeren her bir FACS tüpüne 3 ml akış tamponu ekleyin, ardından hücreleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 660 x g'da (maksimum RCF) döndürün.

Sonuçlar

Şekil 1: Glioma infiltre eden PBMC'lerin izolasyonu. (A) Erken evre ortotopik glioma implantları içeren fare beyin dokusunun diseksiyonu için strateji. Üst panel, ipsilateral hemisferin kontralateral hemisferden uzaktaki sagital kesimini göstermektedir. Alt panel, tümör implantını içeren hedef dokuyu izole etmek için gerekli olan iki ek koronal kesimi gösterir (mor renkle vurgulanmışt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Eagles Medium'u Modifikasyonu	Gibco (Gibco)	12430-054	4.5g / L D-glikoz, L-glutamin, 25mM HEPES ve fenol kırmızısı ile
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Gibco (Gibco)	14190-144	Kalsiyum klorür veya Magnezyum klorür olmadan
Fetal sığır serumu	Omega Bilimsel A.Ş.	FB-11
Penisilin Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122	10.000U/ml Penisilin; 10.000μg/ml Streptomisin
0.6ml konik polipropilen mikrotüpler	Genesee Bilimsel	22-272
Poliüretan buz kovası	Balıkçı markası	02-591-45	Kapasite: 0.152 oz. (4.5L)
Kollajenaz (Tip I-S)	Sigma Aldrich	C1639 Serisi	Başlangıç Clostridium histolyticum
Deoksiribonükleaz I	Worthington Biyokimya A.Ş.	LS002007	> mg kuru ağırlık başına 2.000 Kunitz birimi
Büyük diseksiyon makası	Ted Pella A.Ş.	1316
Küçük diseksiyon makası	FST (Türkçe)	14094-11
Künt uçlu forseps	Ted Pella A.Ş.	13250
7ml cam Dounce doku öğütücü	Kontes Belediyesi	KT885300-0007
Percoll Yoğunluk Santrifüj Ortamı	GE Sağlık	GE17-0891-01
10 mL serolojik pipetler	Genesee Bilimsel	12-104	Tek kullanımlık; steril
70μm steril naylon örgü hücre süzgeçleri	Balıkçı markası	22363548
15ml polipropilen santrifüj tüpleri	Genesee Bilimsel	21-103	Konik alt
50ml polipropilen santrifüj tüpleri	Genesee Bilimsel	21-108	Konik alt
12x75mm yuvarlak tabanlı polipropilen FACS tüpler	Balıkçı markası	14-956-1B

Serisi · adet arası arası