$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Enstrümanların, Kültür Ortamlarının ve Yemeklerin Hazırlanması
- İki paslanmaz çelik laboratuvar diseksiyon makası ve iki paslanmaz çelik laboratuvar forsepsi hazırlayın. Tüm aletleri otoklavlayın ve sterilizasyon için ultraviyole ışık (UV) ışığı altında bir kültür başlığı O/N içine yerleştirin.
- 500 ml minimum esansiyel ortam (MEM) kültür ortamı (%10 Fetal Sığır Serumu [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-glikoz, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin ve 6 μg/ml ampisilin) yapın ve süzgeçle sterilize edin. Aylarca 4 °C'de saklayın.
- 14 mm, 1 numara kalınlığında lameller içeren 24 kuyulu kültür plakası hazırlayın. Lamelleri otoklavlayın ve 100 mg / L poli-d-lizin (PDL) ile kaplayın. UV ışığı O/N'yi sterilize eder.
2. Serebellar Granül Hücre (CGC) Kültür Çözeltilerinin Hazırlanması
- 250 mg glikoz, 300 mg Sığır Serum Albümini [BSA], 955 mg Fosfat Tamponlu Salin [PBS] (Ca2 + ve Mg + içermez) ve 1 ml% 3.8 MgSO4 · 7H2O içeren otoklavlanmış, UV ışığı ile muamele edilmiş, steril dH2O'da 'çözelti A' (100 ml) hazırlayın.
- 9 ml çözelti A içinde seyreltilmiş 1 ml 5 mg / ml tripsin içeren 'çözelti B' (10 ml) hazırlayın.
- 1.000 birim DNaz, 0.5 mg soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 100 μl% 3.8 MgSO4·7H2O içeren 'çözelti C' (10 ml) hazırlayın, çözelti A ile 10 ml'ye seyreltin.
- Çözelti A ile 20 ml'ye seyreltilmiş 3.2 ml C çözeltisi içeren 'çözelti D'yi (20 ml) hazırlayın.
- EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4·7H2O ve% 4 BSA, pH 7.4 içeren BSA / Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) çözeltisini hazırlayın.
- 150 mM LME'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 5 ml MEM kültür ortamına saf LME ekleyerek L-lösin Metil Ester (LME) hazırlayın, çözeltiyi bir tezgah üstü pH metre kullanarak pH 7.4'e geri getirin ve 28 mm polieter sülfon (PES) kullanarak filtre sterilize edin 0.2 μm şırınga filtresi.
3. CGC'lerin kültürlenmesi
- 4-7 günlük sıçan yavrularından serebella toplayın. Hemen buz üzerinde 5 ml çözelti A içeren Petri kabına yerleştirin.
- Fazla çözeltiyi serebelladan dökün ve dokuyu Petri kabının kapağına yerleştirin.
- İyi alevlenmiş bir tıraş bıçağıyla dokuyu en az üç farklı yönde ince ince doğrayın.
- Çözelti B'ye doğranmış doku ekleyin (sınırlı doku kaybını sağlamak için Petri kabını bir çözelti ile durulayın) ve 5 dakika boyunca 37 ° C'deki su banyosuna koyun. Her iki dakikada bir hafifçe çalkalayın.
- Tripsini nötralize etmek için tüpe D çözeltisi (20 ml) ekleyin, çalkalayın ve 5 dakika boyunca 65 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dökün.
- 4 ml'lik çözelti C'de tekrar süspanse edin. Süspansiyon mümkün olduğu kadar homojen olana kadar, çapı azalan üç alevli cam pipetle iyice triture edin (her biri yaklaşık 10 kez).
- BSA/EBSS'nin üzerine bu homojenattan birkaç damla yavaşça ve nazikçe ekleyin. BSA/EBSS'den geçmeye başlarsa, daha fazla tritürasyon yapın ve/veya biraz daha fazla çözelti C ekleyin. Homojenat, BSA/EBSS'nin üzerinde bir tabaka halinde oturmalıdır. Sallamayın. 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün.
- Süpernatanı çıkarın ve peleti (yumuşak) 1 ml MEM ortamında yeniden süspanse edin.
- 500 μl MEM ortamında 800.000 hücre / lamel bir hemositometre ve plaka kullanarak hücreleri sayın. % 6 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Ortamı ertesi gün değiştirin (hazırlıktan 24-36 saat sonra). 10 μM hücre döngüsü inhibitörü arabinofuranosil sitidin (AraC) içeren bir MEM ortamı çözeltisi yapın.
- Her lamel için, eski ortamın 250 μl'sini 24 oyuklu yeni bir plakada tutun, geri kalanını aspire edin, 250 μl normal MEM ortamı ekleyin ve hücreleri yıkamak için bunu aspire edin. Ardından, 250 μl eski besiyerini hücrelere geri ekleyin ve 250 μl AraC içeren besiyeri ile doldurun.
not: Hücreler 6 günden itibaren in vitro (DIV) kullanılabilir.
4. Mikroglia'nın seçici olarak tükenmesi (6 DIV'de gerçekleştirilir)
- 150 mM LME'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 5 ml ayrı bir MEM ortamı alikotuna saf LME ekleyin.
- Çözeltiyi pH 7.4'e geri getirin ve 28 mm polieter sülfon (PES) 0.2 μm şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
- Çözeltiyi MEM ortamında 50 mM (2 x LME) konsantrasyona seyreltin ve kontrol kültürleri için normal MEM ortamı ile birlikte 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin.
- MEM ortamının yarısını (250 μl) CGC kültürlerinden çıkarın ve 37 °C'de tutun.
- Hücreleri 2 x LME (250 μl) içeren MEM ortamı ile muamele edin, yani 25 mM'lik bir iyi konsantrasyon veren 1: 1 oranında seyreltilmiş veya kontrol kültürleri için LME (250 μl) içermeyen önceden ısıtılmış MEM ortamı ile.
- Hücreleri 37 ° C'de% 6 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 1 saat inkübe edin.
- LME içeren ortamı çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış taze MEM ortamında iki kez yıkayın ve ardından tutulan kültür ortamını ve eşit hacimde taze önceden ısıtılmış MEM ortamını karşılık gelen kuyucuklara değiştirin.
- Kültürleri inkübatöre geri koyun (37 ° C'de% 6 CO2 ile nemlendirilir) ve daha fazla işlemden önce 24 saat dinlenmeye bırakın.