1. gün Sprague Dawley sıçan yavrularından beyin dokusu ekstraksiyonu için protokol, dekapitasyon ile ötenazi yapıldı, Alberta Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Mikroglia ve Astrosit İzolasyonları
>NOT: İzolasyon ve hücre kültürü için tüm ortamlar bir su banyosunda 37 °C'ye önceden ısıtılır. Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)% 1 penisilin-streptomisin (PS) içerir. Dulbecco'nun Ham'ın F12 besin karışımı (DMEM/F12) ile modifiye edilmiş tüm Eagle's media'sı %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (PS) ile desteklenir. Sadece tripsin ile karışımlar FBS'den yoksundur. Bu protokoldeki tüm malzemeler sterildir (filtre, alkol, satın alma ve otoklavlama) ve 1.8 numaralı adımdan sonraki her adım aseptik teknikle biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
- Beyin başına, 50 mL konik santrifüj tüplerinde 15 mL HBSS ve 12,5 mL DMEM/F12'yi 37 °C'ye ve 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yaklaşık 2 mL %0,25 tripsin ön ısıtın. 25 mL ilave DMEM/F12 ısıtın. Enzimatik aktivite kaybını önlemek için kullanmadan yaklaşık 10 dakika önce tripsin ısıtın.
- Yüzeyi kaplayacak kadar steril, 6 ve 10 cm'lik kültür kaplarına yeterince ılık HBSS dökün. Her iki beyin için 10 cm'lik bir tabak ve 6 cm'lik ek bir tabak hazırlayın.
- Her 10 cm'lik2 tabağa en fazla 2 beyin yerleştirin (Şekil 1A).
- Diseksiyon mikroskobu altında, orta hat boyunca korteksleri ve beyin sapı ile beyinciği ayırmak için kavisli ve düz forseps kullanın. Bu, beyin başına üç doku bölümü verir (Şekil 1B).
- Dokunun her bir bölümünden kan damarları içeren ince, yarı saydam doku tabakasını (meninksler) soyun ve atın, kalan dokuyu ayrı bir kültür kabına aktarın. Doku kesiklerinin açığa çıkardığı ince tabakaları forseps ile kavrayın ve büyük kısımlar beyin dokusundan 'sarkana' kadar dikkatlice çekin. Son olarak, bu kısmı hafifçe çekerek çıkarın. Bu adımdan önce, sırasında ve sonrasının temsili görüntüleri için Şekil 1C-1E'ye bakın.
- Bir biyogüvenlik kabininde, kalan HBSS'yi kültür kabından çıkarın ve dokuyu dikkatlice tutun. Dokuyu bir neşter ile yumuşatın ve dokuyu tripsin ile önceden ısıtılmış 15 mL tüpe aktarın.
- Dokuyu enzimatik olarak sindirmek için bu tüpü 37 ° C'lik bir banyoda 25 dakika inkübe edin.
- Tüpü oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, tripsini etkisiz hale getirmek için 10 mL ılık DMEM / F12 ekleyin ve dokuyu parçalamak için çözeltiyi 5 kez ezin.
- Tüpü oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, peleti 10 mL ılık DMEM / F12'ye yeniden süspanse edin ve çözeltiyi 50 mL'lik bir Konik santrifüj tüpüne aktarın.
- 18 gauge iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, çözeltiyi 3 kez tritüre edin.
- Bu çözeltiyi beyin başına 12.5 mL ılık DMEM / F12'lik artışlarla dağıtın.
- Tritüre çözeltinin 1 mL'lik artışlarını 12 oyuklu bir plakaya (beyin başına 1) pipetleyin.
- Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Medyayı üç gün sonra değiştirin ve sonraki üç günde bir medyayı yenileyin. 2 hafta sonra, hücreler deneyler için toplanabilir.
2. Makromer Sentezi
- 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde 375 mg hyaluronik asit (HA) tuzunu tartın ve 37.5 mL damıtılmış su ekleyin.
- Çözeltiyi 1 dakika boyunca bir girdap ile yıkayın ve karışımı homojen görünene ve jel benzeri viskozitesini kaybedene kadar sonikleştirin. Bu işlem 6 saat sürebilir.
- Çözeltiyi manyetik karıştırma çubuklu (38 mm) 100 mL'lik bir behere aktarın ve oda sıcaklığında kuvvetlice karıştırın.
- 5.0 M NaOH'yi karışım HA'sına dikkatlice titre edin ve pH 8 ile 12 arasında stabilize olana kadar pH kağıdı ile ölçün.
- Depolama sırasında nitrojenle örtülmüş 3 mL taze metakrilik anhidrit (MA, %94) toplayın.
not: MA atmosfere uzun süre (günlerce) maruz kalırsa, reaktivitesini kaybeder.
Dikkat: MA'nın tüm kullanımı bir davlumbazda yapılmalıdır.
- Karışım HA çözeltisine 200 μL MA ekleyin. Reaksiyon, çözeltinin pH'ını 8'in altına düşürür.
- Çözeltiye 3 mL MA eklenene kadar 2.4 ila 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın. Bu işlem 1-2 saat kadar sürebilir.
- Reaksiyonun karıştırmadan gece boyunca 4 °C'de devam etmesine izin verin.
- Çözeltiyi 500 mL'lik bir beherde 400 mL soğuk etanole (EtOH) aktarın ve 4 ° C'de 24 - 72 saat çökeltmeye izin verin.
- Çözeltinin büyük bir kısmını bertaraf etmek için ayrı bir behere dikkatlice boşaltın ve çökeltiyi 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Bu, gerekirse 2-4 tüp halinde dağıtılabilir.
- Tüpleri 200 x g'da oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir santrifüjde santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Tüpü soğuk EtOH ile doldurun, çözeltiyi 1 dakika boyunca bir girdap ile karıştırın ve 2.10-2.11 adımını tekrarlayın.
- 25 mL steril deiyonize su ekleyin, çözeltiyi 1 dakika boyunca bir girdap ile karıştırın, 1 saat boyunca sonikat (>20 kHz) ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Çözeltiyi -80 °C'lik bir dondurucuda 15 dakika veya sıvı nitrojen içinde donana veya hızlı donmaya kadar yerleştirin.
Dikkat: Sıvı nitrojen kullanırken koruyucu eldiven, yüz siperi ve önlük kullanın.
- Tüpü (0,1 mBar ve -30 °C'nin altında) kar benzeri bir toz oluşana kadar 24 - 48 saat dondurarak kurutun.
- Bu noktada, HA omurgası üzerindeki metil protonlara (1.9 ppm) göre metakrilat protonlarının miktarının (6.1 ve 5.6 ppm'de zirve yapar) 1 H nükleer manyetik rezonans yoluyla saflık açısından test edin. Metil protonlara minimum% 95 metakrilat oranı kabul edilebilir.
3. Jel Oluşumu ve 3D Kapsülleme
- Lamel ve Kalıp Hazırlama
- 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde %2'lik 3- (Trimetoksisilil) propil metakrilattan 50 mL damıtılmış su çözeltisi yapın.
- 18 mm'lik cam lamelleri çözeltiye koyun ve oda sıcaklığında 1 saat sallayın. Aynı anda en fazla 50 lamel eklenebilir.
- Lamelleri, her birini 100 mL deiyonize su içeren 3 behere seri olarak daldırarak durulayın.
- Lamelleri bir kurutucu ve fırın ile gece boyunca 40 °C'de bir vakumda kurutun.
- Tek tek lameller forseps ile% 70 EtOH'ye hızla daldırın.
- Kurutmadan, her bir lamel 12 oyuklu bir plakanın kuyusuna bırakın.
- Her kuyucuğu steril deiyonize suyla (kuyu başına 1 mL) yıkayın ve aspire edin.
- Her oyuğa 1 mL steril 2 μg / mL poli-L-lizin (PLL) ekleyin ve >2 saat inkübe edin.
- PLL solüsyonunu aspire edin ve lamellerin kurumasını bekleyin.
- Polidimetil siloksan (PDMS) kalıplarını (bkz. Şekil 2) %70 EtOH'ye daldırın ve her lamel ortasına bir tane yerleştirin ve kurumaya bırakın ve kalıp ile cam arasında bir sızdırmazlık oluşturun.
- PDMS premiks reaktiflerini düz tabanlı bir polistiren kapta 10:1 oranında dökerek PDMS kalıplarını hazırlayın. Hazırlanan PDMS miktarı, yaklaşık 1 mm kalınlığında bir tabaka elde edecek şekilde seçilir. PDMS'de kuyular oluşturmak için, tabakaları iç çapı 10 olan bir daire zımba ile kesin.
- Hücre Hazırlama
NOT: Protokoldeki tüm adımlar biyogüvenlik kabininde steril teknikle gerçekleştirilmektedir. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi, tüm adımlar için pH 7.4'e ayarlanır.
- Metakrillenmiş hyaluronik asitte (HAMA) hücre kapsüllemesinden 24 saat önce, 12 oyuklu plakadaki 2 haftalık birincil kültürler (Adım 1.15'ten itibaren) için ortamı yenileyin. Kuyucuk başına 1 mL DMEM / F12 (% 10 FBS ve% 1 PS) ortamı ekleyin.
- Her 12 oyuklu hücre plakası için 12.5 mL seyreltik tripsin (%0.25 tripsin-EDTA, %30 DMEM / F12 ortamı ile seyreltilmiş) ve 25 mL DMEM/F12 (%10 FBS ve %1 PS) hazırlayın ve bir su banyosunda 37 ° C'de ısıtın.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet (kuyucuk başına > 0.5 mL) kullanarak plakalardan şartlandırılmış ortamı toplayın, kalan sıvıyı iyice aspire edin ve seyreltik tripsin oyuk başına 1 mL ile değiştirin (% 0.075 tripsin-etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) 20-30 dakika boyunca bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO2) birleşik hücre tabakası plakadan ayrılana kadar.
- Asılı hücre materyalini 1 mL'lik bir pipetle (tek bir yüzen parça olarak görünür) geri kazanın ve 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Eşdeğer hacimde DMEM / F12 (% 10 FBS ve% 1 PS) ile seyreltin ve süpernatanı atarak oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini 10 mL ılık DMEM / F12'de (% 10 FBS ve% 1 PS) yeniden süspanse edin, hücreleri 10 mL'lik bir pipetle 5 kez tritüre edin ve 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı boşaltın, hücreleri 5 mL ılık DMEM / F12'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.
- 18 gauge iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, hücre çözeltisini 3 kez tritüre edin ve süspansiyonu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir konik santrifüj tüpüne süzün.
- 10 μL hücre süspansiyonu toplayın, ılık DMEM / F12'de 1:100 oranında seyreltin ve otomatik bir hücre sayacı ile hücreleri sayın.
- Kapsülleme aşamasına kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
- Hücre Kapsülleme
NOT: Protokoldeki tüm adımlar biyogüvenlik kabininde steril teknikle gerçekleştirilmektedir.
- Her 12 oyuklu 3D hidrojel plakası için, hücre hazırlığı sırasında toplanan 12.5 mL DMEM / F12 ve 12.5 mL şartlandırılmış DMEM / F12 ortamını ısıtın.
- Ağırlıkça %0,5'lik bir nihai konsantrasyon için gereken HAMA miktarını tartın. Bu HAMA'yı steril filtrelenmiş PBS'de (ağırlıkça %2/hacim) bir konsantrasyonda çözün; hücrelerin ve diğer reaktiflerin eklenmesini sağlamak için nihai konsantrasyondan 4 kat daha yüksek bir konsantrasyon kullanılır. 12 oyuklu bir hidrojel plakası, 7 mg HAMA ile ~ 350 μL PBS gerektirir.
- HAMA 60 dakika boyunca tamamen çözülene kadar sonikasyon (>20 kHz) çözeltileri.
- Hem trietanolamin (TEA) hem de 1-vinil-2-pirolidinon (NVP) için% 10'luk ayrı ayrı çözeltiler ve steril PBS pH 7.4'ün 1 mL alikotlarında 1 mM'lik bir Eosin Y (EY) çözeltisi hazırlayın.
- 12 oyuklu bir plaka için, 1 x 107 hücre, %0,5 ağırlık/hacim HAMA (350 μL ağırlıkça %2/hacim), %0,1 TEA (%14 μL %10), %0,1 NVP (%14 μL %10) ve 0,01 mM EY (14 μL 1 mM) ve %20 bazal lamina karışımı (280 μL stok). Kalan birim PBS'dir.
- Solüsyonu nazikçe karıştırın ve 1 mL'lik bir uçla her bir PDMS kalıbına 100 μL pipetleyin.
- Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yüksek yoğunluklu yeşil LED ışığa (~520 nm, 60 mW, kapalı 20 cm x 20 cm x 20 cm kutuda) maruz bırakın.
- 12 oyuklu bir plakaya ılık şartlandırılmış DMEM / F12 kuyusu başına 1 mL ekleyin.
- Her bir lameli başparmağınız ve işaret parmağınız arasında kavrayın, jeli yerinden çıkarmamaya dikkat ederek PDMS kalıbını kavisli cımbızla yavaşça soyun ve şartlandırılmış bir ortama sahip bir kuyuya yerleştirin.
- Her kuyucuğa 1 mL daha ılık DMEM / F12 ekleyin.
- Plakaları 37 ° C'de 2 hafta boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin, her hafta 1 oyuktan 1 mL ortam pipetleyerek ve 1 mL DMEM / F12 ile değiştirerek hücre ortamını yenileyin.
