$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücre Kültürü ve Reaktif Hazırlama
- Hücre kültürü için kaplanmış plakalar hazırlayın.
- 1 mg / mL stok çözeltisi hazırlamak için hücre dışı matris (ECM) kaplama çözeltisini DMEM / F12 ortamı ile seyreltin. Seyreltilmiş ECM stok çözeltisini her biri 3 mL'lik 30 konik tüpe koyun ve hemen -20 °C'de saklayın. Çalışan bir çözelti için, 3 mL ECM stoğunu 33 mL önceden soğutulmuş DMEM/F12 ortamına yeniden süspanse edin ve toplam hacmi 80 μg/mL'lik bir konsantrasyon için 36 mL'ye getirin.
- ECM çalışma çözeltisi ile 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasının oyuklu başına 1 mL kaplayın. Kuyu yüzeyinin tamamen kaplandığından emin olmak için kuyu başına (gerekirse) ek 1 mL DMEM / F12 ekleyin. Kaplanmış 6 oyuklu hücre kültürü plakalarını kullanmadan önce en az 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
NOT: Kaplanmış plakalar inkübatörde veya 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Ortam formülasyonları, büyüme faktörleri ve küçük moleküller hazırlayın.
- 500 mL insan pluripotent kök hücre (hPSC) ortamı hazırlamak için, üreticilerin talimatlarına göre 20x ve 500x takviyeleri ekleyin.
- 500 mL nöral ortam (NM) hazırlamak için, 2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona heparin, 1x antibiyotik / antimikotik çözelti, 1x B27 takviyesi veya 1x N2 takviyesi, daha önce detaylandırıldığı gibi L-glutamin takviyesi ile 500 mL'lik bir DMEM / F12 şişesine ekleyin.
- 10 mM (1.000x) Rho-kinaz inhibitörü Y27632 (Y) stok çözeltisi hazırlamak için, 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içine 10 mg toz ekleyin. Süzün, sterilize edin, ayırın ve -20 °C'de saklayın. Ortamda 10 μM çalışma konsantrasyonunda kullanın.
- 20 mM (10.000x) SB431542 stok çözeltisi hazırlamak için, 1.3 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içine 10 mg toz ekleyin. 2 mM (1.000x) DMH1 stok çözeltisi hazırlamak için, 13.1 mL DMSO'ya 10 mg toz ekleyin. Her çözeltiyi süzün, sterilize edin, ayırın ve -20 °C'de saklayın. Her birini ortamda 2 μM çalışma konsantrasyonunda kullanın (NM + SB431542 + DMH1).
not: Bu protokol, gözlemlerimize ve bu konsantrasyonun hPSC'lerden nöral indüksiyonu etkili bir şekilde desteklediğini belirten diğerlerinden gelen raporlara ve gözlemlerimize dayanarak hem SB431542 hem de DMH1'in 2 μM çalışma konsantrasyonlarını önermektedir. Daha yüksek konsantrasyonlar da bildirilmiştir30. Ek olarak, alternatif ortamlarda, yüksek nöral dönüşüm için küçük moleküllerin gerekli olmadığı da gösterilmiştir. Bu nedenle, çalışma konsantrasyonları alternatif hücre kültürü ortamlarına bağlı olarak değişecektir ve optimal konsantrasyonlar bireysel araştırmacılar tarafından test edilmelidir.
- Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü-2'nin (FGF2) ayrı ayrı 100 μg / mL (10.000x) stok çözeltilerini hazırlamak için, 10 mL PBS +% 0.1 BSA'ya her birinden 1 mg ekleyin. Aliquot EGF ve FGF2 stoklama solüsyonlarını 50 μL'lik alikotlara ayırır ve -80 °C'de saklar. Her birini ortamda 10 ng / mL çalışma konsantrasyonunda kullanın; örneğin, 5 μL EGF ve 5 μL FGF2 ila 50 mL NM (NM + EGF + FGF2) ekleyin.
- Bir doksisiklin hidroklorür (Dox) stok çözeltisi hazırlamak için, önce tozu DMSO'da 100 mg / mL'ye çözün ve -20 ° C'de saklayın. Ayrıca, PBS'de 2 mg / mL (1.000x) stok çözeltisi yapmak için seyreltin ve -20 ° C'de saklayın. Ortamda 2 μg / mL çalışma konsantrasyonunda kullanın; örneğin, 50 mL NM'ye (NM + Dox) 50 μL Dox ekleyin.
not: Çözüldükten sonra çözeltileri tekrar dondurmayın.
2. İnsan Kaynaklı Pluripotent Hücrelerden (hPSC'ler) Nöral Alt Tiplerin Üretilmesi
NOT: Tüm hücre kültürleri, 37 °C'de %5 CO2 içeren bir inkübatörde muhafaza edilmelidir. Bu kültürler oda oksijen seviyelerinde tutulur, ancak daha düşük seviyeler kullanılabilir.
- hPSCs.
'den astrosit progenitörleri (hAstros) oluşturun ve koruyun
not: Bu bölümde kısa ve basitleştirilmiş bir farklılaşma protokolü sunulmaktadır. Ayrıntılı bir açıklama için (embriyoid vücut oluşumu, rozet seçimi ve bölgesel modelleme adımları ile), daha önce açıklanan protokole bakın (Şekil 1A, noktalı yeşil kutu).
- hPSC'lerin tohum kümeleri (Şekil 1B), oyuk başına 2 mL hPSC ortamı + Y ile ECM kaplı 6 oyuklu plakalara (bkz. adım 1.1). Kök hücreleri her gün yaklaşık% 50 birleşene ve gerektiği gibi bölünene kadar besleyin.
- hPSC'leri bölmek için, kuyucuklara 1 mL geçiş reaktifi ekleyin ve 1 dakika sonra aspire edin. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, 1 mL hPSC ortamı ekleyin ve agregaları 1:10 oranında oyuk başına 2 mL hPSC ortamı + Y'de yeni ECM kaplı oyuklara bölün.
- Kök hücreleri yaklaşık% 50 birleşene kadar koruyun, daha sonra nöral farklılaşmayı indüklemek için ortamı NM + SB431542 + DMH1 olarak değiştirin (gün 0). Hücreler yaklaşık %95 oranında birleştiğinde, 1:6 oranında bölünerek aynı ortamda yeni ECM kaplı kuyucuklara bölün.
- 14. günde, hücreleri ayırma çözeltisi ile ayırın ve agrega oluşumunu teşvik etmek için bunları Y ile kaplanmamış bir şişeye aktarın.
not: Y ilavesi, hücre sağkalımını ve küre oluşumunu teşvik etmek için kullanılır, ancak her besleme sırasında dahil edilmez.
- Nöronal progenitörlerin ve nöronların (hNeuronlar) üretilmesi için, bu gün-14 hücrelerini aşağıda açıklandığı gibi kullanın. Alternatif olarak, bu hücreleri, nöronal olgunlaşma meydana gelmeden veya gliogenez başlamadan önce tek tabaka veya küre kültürlerinden daha sonraki zaman noktalarında kullanın.
not: Varsayılan olarak, bu protokol dorsal-kortikal astrositler üretir. Bununla birlikte, astrosit alt tipleri, istenirse desen morfojenlerinin eklenmesiyle bölgesel olarak belirlenebilir. Hücreleri omurilik fenotiplerine kaudalize etmek için retinoik asit (RA) eklenebilirken, sonik kirpi (SHH), düzleştirilmiş agonist (SAG) veya purmorfamin ventral fenotipler üretecektir.
- Kendiliğinden oluşan 3D agregalarda (hAstrospheres) astrosit öncüllerinin ve astrositlerin üretilmesi için, NM + EGF + FGF2'ye geçin ve daha önce detaylandırıldığı gibi haftalık olarak (veya stabil pH sağlamak için gerektiği kadar) besleyin.
- Karanlık merkezler ortaya çıktığında hAstro agregalarını ayırma solüsyonu ile nazikçe ayırın ve kendiliğinden yapışan küreleri çıkarın. Küre sağlığını korumak ve nekrotik çekirdeklerden kaçınmak için küreleri haftada bir kez nazikçe kırın.
not: Ayrılma çözeltisi ile 5 dakikalık tedaviyi aşmayın.
- 4-6 aylık genişlemeden sonra, hücre kimliğini doğrulayın ve kriyoprezervasyon ortamında (üreticinin talimatlarına göre) dondurun veya sıvı nitrojende uzun süreli koruma için alternatif saklama koşullarında dondurun veya deney için hemen kullanın.
