$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deneyler yapılırken etik onaylar alındı.
1. Hücre Kültürü ve Reaktif Hazırlama
- Hücre kültürü için kaplanmış plakalar hazırlayın.
- 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı F-12 (DMEM / F12) ortamı ile hücre dışı matris (ECM) kaplama çözeltisini seyreltin. Seyreltilmiş ECM stok çözeltisini her biri 3 mL'lik 30 konik tüpe koyun ve hemen -20 °C'de saklayın. Çalışan bir çözelti için, 3 mL ECM stoğunu 33 mL önceden soğutulmuş DMEM/F12 ortamına yeniden süspanse edin ve toplam hacmi 80 μg/mL'lik bir konsantrasyon için 36 mL'ye getirin.
- ECM çalışma çözeltisi ile 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasının oyuklu başına 1 mL kaplayın. Kuyu yüzeyinin tamamen kaplandığından emin olmak için kuyu başına (gerekirse) ek 1 mL DMEM / F12 ekleyin. Kaplanmış 6 oyuklu hücre kültürü plakalarını kullanmadan önce en az 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
not: Kaplanmış plakalar inkübatörde veya 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Ortam formülasyonları, büyüme faktörleri ve küçük moleküller hazırlayın.
- 500 mL insan pluripotent kök hücre (hPSC) ortamı hazırlamak için, üreticilerin talimatlarına göre 20x ve 500x takviyeleri ekleyin.
- 500 mL nöral ortam (NM) hazırlamak için, 2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona heparin, 1x antibiyotik / antimikotik çözelti, 1x B27 takviyesi veya 1x N2 takviyesi, daha önce detaylandırıldığı gibi L-glutamin takviyesi ile 500 mL'lik bir DMEM / F12 şişesine ekleyin.
- 10 mM (1.000x) Rho-Kinaz İnhibitörü Y27632 (Y) stok çözeltisi hazırlamak için, 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içine 10 mg toz ekleyin. Filtre sterilize edin, ayırın ve -20 ° C'de saklayın. Ortamda 10 μM çalışma konsantrasyonunda kullanın.
- 20 mM (10.000x) SB431542 stok çözeltisi hazırlamak için, 1.3 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içine 10 mg toz ekleyin. 2 mM (1.000x) DMH1 stok çözeltisi hazırlamak için (4- [6- (4-İzopropoksifenil) pirazolo [1,5-a] pirimidin-3-il] kinolin, 4 - [6- [4- (1-Memetetoksi) fenil] pirazolo [1,5-a] pirimidin-3-il] -kinolin), 13.1 mL DMSO'ya 10 mg toz ekleyin. Filtre, sterilize edin, alikotlayın ve her çözeltiyi -20 ° C'de saklayın. Her birini ortamda 2 μM çalışma konsantrasyonunda kullanın (NM + SB431542 + DMH1).
not: Bu protokol, gözlemlerimize ve bu konsantrasyonun hPSC'lerden nöral indüksiyonu etkili bir şekilde desteklediğini belirten diğerlerinden gelen raporlara ve gözlemlerimize dayanarak hem SB431542 hem de DMH1'in 2 μM çalışma konsantrasyonlarını önermektedir. Daha yüksek konsantrasyonlar da bildirilmiştir. Ek olarak, alternatif ortamlarda, yüksek nöral dönüşüm için küçük moleküllerin gerekli olmadığı da gösterilmiştir. Bu nedenle, çalışma konsantrasyonları alternatif hücre kültürü ortamlarına bağlı olarak değişecektir ve optimal konsantrasyonlar bireysel araştırmacılar tarafından test edilmelidir.
- Bir doksisiklin hidroklorür (Dox) stok çözeltisi hazırlamak için, önce tozu DMSO'da 100 mg / mL'ye çözün ve -20 ° C'de saklayın. PBS'de 2 mg / mL (1.000x) stok çözeltisi yapmak için daha fazla seyreltin ve -20 ° C'de saklayın. Ortamda 2 μg / mL çalışma konsantrasyonunda kullanın; örneğin, 50 mL NM'ye (NM + Dox) 50 μL Dox ekleyin.
not: Çözüldükten sonra çözeltileri tekrar dondurmayın.
2. İnsan Kaynaklı Pluripotent Hücrelerden (hPSC'ler) Nöral Alt Tiplerin Üretilmesi
NOT: Tüm hücre kültürleri, 37 °C'de %5CO2 içeren bir inkübatörde tutulmalıdır. Bu kültürler oda oksijen seviyelerinde tutulur, ancak daha düşük seviyeler kullanılabilir.
- hPSC'lerden astrosit progenitörleri (hAstros) oluşturun ve koruyun.
not: Bu bölümde kısa ve basitleştirilmiş bir farklılaşma protokolü sunulmaktadır. (Şekil 1A, noktalı yeşil kutu).
- Oyuk başına 2 mL hPSC ortamı + Y olacak şekilde ECM kaplı 6 oyuklu plakalara hPSC'lerin tohum kümeleri (Şekil 1B). Kök hücreleri her gün yaklaşık% 50 birleşene ve gerektiği gibi bölünene kadar besleyin.
- hPSC'leri bölmek için, kuyucuklara 1 mL geçiş reaktifi ekleyin ve 1 dakika sonra aspire edin. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, 1 mL hPSC ortamı ekleyin ve agregaları 1:10 oranında oyuk başına 2 mL hPSC ortamı + Y'de yeni ECM kaplı oyuklara bölün.
- Kök hücreleri yaklaşık% 50 birleşene kadar koruyun, daha sonra nöral farklılaşmayı indüklemek için ortamı NM + SB431542 + DMH1 olarak değiştirin (gün 0). Hücreler yaklaşık %95 oranında birleştiğinde, 1:6 oranında bölünerek aynı ortamda yeni ECM kaplı kuyucuklara bölün.
- 14. günde, hücreleri ayırma çözeltisi ile ayırın ve agrega oluşumunu teşvik etmek için Y ile kaplanmamış bir şişeye aktarın.
not: Y ilavesi, hücre sağkalımını ve küre oluşumunu teşvik etmek için kullanılır, ancak her besleme sırasında dahil edilmez.
- Nöronal progenitörlerin ve nöronların (hNeuronlar) üretilmesi için, transgenik hücreler için tarif edildiği gibi farklılaşmak için bu gün-14 hücrelerini kullanın.
- hPSC'lerden indüklenebilir nöronlar (iNeuronlar) oluşturun ve koruyun.
- Tohum transgenik hPSC'leri (stabil bir doksisiklin ile indüklenebilir nörogenin 2 transgeni ile) oyuk başına 2 mL hPSC ortamı + Y ile ECM kaplı 6 oyuklu plakalar üzerinde (transgenik olmayan hatlar için yukarıda açıklandığı gibi). % 70 birleşmede kaldırmaya hazır olana kadar her gün kuyu başına 2 mL ortam ile besleyin. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi bölün.
- Hücreler yaklaşık% 35 birleştiğinde, iNeurons'a farklılaşmayı indüklemek için NM + Dox ekleyin.
not: Hücreler nöronal progenitörlere dönüşecek, ancak henüz nöritleri uzatmayacak.
