Sinaps Oluşumunu İndüklemek için Astrositlerin ve Nöronların 3D Ko-Kültür Kürelerinin Oluşturulması

Özet

Kaynak: Cvetkovic, C., et al. İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Astrositlerin ve Nöronların 3D Kokültürleri ile Sinaptik Mikro Devre Modellemesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, 3B küreler oluşturmak için astrositleri ve nöronları birlikte kültürlemek için bir prosedürü göstermektedir. Bu 3B küreler, sinaps oluşumunu ve sinir ağı entegrasyonunu incelemek için ayrı bir platform sağlar, böylece gelişimsel sinirbilim, nörodejeneratif hastalıklar ve nörofarmakolojik müdahalelerde araştırma için potansiyel bir model görevi görür.

Protokol

1. 3D Küre Kokültürlerinin Hazırlanması ve Bakımı

1. hAstros'u süspansiyondaki 3B agregalardan ayırın.​
   1. Karanlık merkezler ortaya çıktığında insan astrosit (hAstro) agregalarını ayırma solüsyonu ile nazikçe ayırın ve kendiliğinden bağlanan küreleri çıkarın. Küre sağlığını korumak ve nekrotik çekirdeklerden kaçınmak için küreleri haftada bir kez nazikçe kırın.
      NOT: Ayırma solüsyonu ile 5 dakikalık tedaviyi aşmayın.
2. hNeuron'ları veya iNeuron'ları 2B tek katmandan ayırın.
   1. Ortamı 6 oyuklu plakadan çıkarın ve hNeuron (insan nöronu) veya iNeurons'un (indüklenebilir nöronlar) her iyi içeren tek katmanlı kültürüne 500 μL ayırma çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Bağlı hücreleri çıkarmak için yavaşça 2-3 mL DMEM / F12 bazal ortam ekleyin.
   2. Hücreleri ve ortamı 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 300 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, 1 mL taze ortam ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 1.000 μL'lik bir mikropipet ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Mikrokuyu kültür plakalarını kullanarak 3D küreler oluşturun.
   1. Mikro kuyu plakasının her bir oyuğuna 0,5 mL yapışma önleyici durulama solüsyonu ekleyerek plakayı hazırlayın. Santrifüj plakasını 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin. Durulama solüsyonu, yıkamak için her kuyucuğa 1 mL DMEM / F12 bazal ortam ekleyin ve tekrar aspire edin.
      not: Kullanım sırasında daima santrifüjün dengeli olduğundan emin olun.
   2. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak her hücre tipini sayın. Toplam 2 mL nöral ortam (NM) + Y hacminde her bir oyuğa istenen ayrışmış hAstros ve hNeuron veya iNeuron oranını ekleyin (iNeuronlar kullanılıyorsa Dox dahil). Plakayı 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin ve inkübatöre geri dönün.
      NOT: 24 oyuklu mikrokuyu plakaları (Malzeme Tablosuna bakınız) kuyucuk başına 300 mikrokuyu içerir. Oyuk başına 2 mL ortama en az 6 x 10⁵ hücre (her biri 2 x 10,³ hücreli küreler için) ve maksimum 6 x 10⁶ hücre (her biri 2 x 10,⁴ hücreli küreler için) ekleyin. Bu aralıktaki belirli bir yoğunluğa sahip canlı küreler için, belirli bir miktarda hücre kullanın ve küre başına hücre sayısını hesaplamak için 300'e bölün. İstenirse alternatif küre oluşturma yöntemleri ve araçları da kullanılabilir. Kabul edilebilir hücre yoğunluğu aralıkları için üreticinin talimatlarına uyun.
   3. Hücrelerin önümüzdeki 2 gün boyunca mikro kuyu plakaları içinde yoğun bir şekilde paketlenmiş küreler halinde kendi kendine bir araya gelmesine izin verin (Şekil 1A). Kültür sararıyorsa ortamın %50'sini değiştirin.
      not: Küreleri rahatsız etmemek için ortamı çıkarırken ve eklerken yalnızca yarım ortamı değiştirin ve nazikçe pipetleyin. Küreler mikro kuyulardan kalkabilir ve daha yüksek kuvvetle birleşebilir.
   4. 2 gün sonra, 1.000 μL'lik bir mikropipet ile küreleri mikro kuyulardan nazikçe çıkarın (Şekil 2D). Yapışmış ek küreleri çıkarmak için ortamla birlikte mikro kuyuların dibine hafifçe kuvvet uygulayın. Kürelerin 15 mL'lik konik bir tüpe yerleşmesine izin verin, eski ortamı aspire edin ve taze ortam ekleyin.
4. 3D küreler oluşturmak için döner şişe biyoreaktör sistemini kurun.​
   1. Manyetik bir karıştırma plakasının yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin ve bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Sterilize etmek için tek tek eğirici şişeleri otoklavlayın.
   2. Her bir eğirme şişesine en az 50-60 mL ortam içeren küreler ekleyin (Şekil 2D, iç). Şişeyi 60 rpm'ye ayarlanmış manyetik karıştırma plakasına yerleştirin. Veri toplamaya hazır olana kadar eğirme şişelerindeki kültür küreleri.
      not: Sinaps oluşumu için kültürde en az 3 hafta gereklidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Biyomühendislik ürünü 3D nöral kürelerin sistematik ve tekrarlanabilir üretimi. (A) Mikrokuyu (μ-kuyucuk) kültür plakaları, sistematik ve kullanıcı tarafından belirlenen bir şekilde istenen yoğunlukta ve nöron-astrosit oranlarında 3D nöral küreler oluşturmak için kullanılır ve tutarlı boyut ve şekil verir. Görüntüler küre oluşumundan 1 gün sonra gösterilir. Ölçek çubukları = ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 kuyulu plaka	Balıkçı Bilimsel	08-772-1B
15 ml konik tüpler	Olympus Plastik	28-101
Aktataz	Sigma	A6964-100ML	Ayırma çözümü
AggreWell plakası	Kök Hücre Teknolojileri	34850
Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu	Kök Hücre Teknolojileri	7010	Mikrokuyu plakalarına hücre yapışmasını önleyin
Anti/anti	Termo Balıkçı	15240062
B27	Termo Balıkçı	17504044	Medya Eki
BrainPhys nöronal ortam	Kök Hücre Teknolojileri	5790	Nörofizyolojik bazal ortam alternatifi
DMEM/F12	Termo Balıkçı	10565-042	GlutaMAX takviyesi ile
DMH-1	Kök Hücre Teknolojileri	73634	TEHLİKE: Yutulması halinde toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: 2 uM
Eşek serumu	Lampire Biyoloji Laboratuvarları	7332100	Çalışma konsantrasyonu: Birincil engelleme tamponunda %5, ikincil engelleme tamponunda %1
Doksisiklin Hidroklorür (Dox)	Sigma	D3072-1ml	TEHLİKE: Hamile kadınlar için toksiktir. Çalışma konsantrasyonu: 2 ug / mL
Epidermal büyüme faktörü (EGF)	Peprotech teknolojisi	AF-100-15	Çalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL
Fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF)	Peprotech teknolojisi	100-18B	Çalışma konsantrasyonu: 10 ng/mL
Hematitometre veya otomatik hücre sayacı	Yaşam Teknolojileri	AMQAX1000
Matrigel membran matrisi	Corning	354230	ECM kaplama çözümü. Çalışma konsantrasyonu: 80 ug / ml. Buz üzerinde hazırlayın ve pipetlerin, tüplerin ve ortamın önceden soğutulduğundan emin olun.
MEA 2100 Sistemi	Çok Kanallı Sistemler	MEA2100
Rho-kinaz inhibitörü Y27632- (Y)	Tocris (Türkçe)	1254	Çalışma konsantrasyonu: 10 uM
SB431542	Kök Hücre Teknolojileri	72234	Çalışma konsantrasyonu: 2 uM
Eğirme şişeleri	Balıkçı Bilimsel	4500-125
T25 Kültür Şişesi	Olympus Plastik	25-207	Havalandırmalı kapaklar
Tripan mavisi	Canlandırıcı	T10282

Serisi Adet Sertifikası Serisi Serisi Serisi arası arası Serisi