Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Sıçan MSC Kültürlerinin Hazırlanması
- Femurdan MSC'lerin toplanması
- Tüm diseksiyon aletlerini (yani ince diseksiyon makası, künt uçlu kesme makası ve dişli forseps) kullanmadan önce en az 2 saat boyunca 180 °C'de otoklavlayın.
- % 15 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S,% 1 v / v) ile desteklenmiş minimal esansiyel ortam - alfa modifikasyonu (αMEM) içeren MSC büyüme ortamını hazırlayın.
- Genç erkek Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g vücut ağırlığı) pentobarbiton doz aşımı (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal) ile kurban edin.
not: Farklı sıçanlardan alınan ilik örnekleri ayrı ayrı işlenmelidir.
- Kurban edilen hayvanları sırtüstü pozisyona getirin. Karınlarını ve alt uzuvlarını %70 etanol ile iyice temizleyin.
- İnce diseksiyon makası ve forseps kullanarak medial uylukların üzerindeki cildi ve deri altı dokusunu çıkarın. Femur açığa çıkana kadar uyluk kaslarını çevresel olarak çıkarın. Diz ve kalça eklemleri görülene kadar proksimal ve distal olarak devam edin. Künt uçlu kesme makası kullanarak uyluk kemiğini kalça ve diz ekleminden ayırın.
not: Bu aşamada kemik iliği boşluğunu ortaya çıkarmak için uyluk kemiğini kesmeyin. Sağlam femurları daha sonraki işlemler için laminer akışlı bir doku kültürü başlığına aktarın.
- Femurun distal ve proksimal uçlarını metafiz yoluyla kesmek için künt uçlu kesme makası kullanın.
- 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Açıkta kalan femoral kanala fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) içeren 21 G, 10 mL'lik bir şırınga yerleştirin ve tekrarlanan yıkama ile ilik içeriğini konik tüpe yıkayın.
not: Her uyluk kemiğini yıkamak için yaklaşık 20 mL PBS kullanılır. Yıkanan içeriğin rengi kan lekeli ve bulanık kalırsa, daha büyük bir hacim kullanılabilir.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 480 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı atın. Hücre peletini 10 mL MSC büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 cm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Doku kültürü kaplarını bir hücre inkübatörüne yerleştirin (37 °C, %5 CO2). Kaplamanın ilk gününü 0.
günü olarak kaydedin
not: Santrifüjlemeyi içeren tüm adımlarda, freni maksimum yavaşlama için ayarlayın.
- MSC kolonilerinin kurulması ve genişletilmesi
not: Bu protokol, kemik iliği boşluğu içinden MSC'leri seçmek için doku kültürü plastik yapışmasına dayanır. Kemik iliği içeriğinin 2 gün boyunca doku kültürü plastiğine yapışmasına izin verilir.
- 2. günde, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kültür plakalarını 10 mL PBS ile üç kez durulayın. Durulamadan sonra PBS'yi 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve her 3 günde bir MSC büyüme ortamı ile doldurun.
not: MSC kolonileri 6-7. günde görünür olmalıdır (Şekil 1A).
- Büyüme ortamını çıkararak ve hücreleri PBS ile durulayarak hücreleri 10. güne kadar geçirin. 1.5 mL rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonu nötralize etmek için 3 mL MSC büyüme ortamı ekleyin. Ayrılan hücreleri 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- PBS'de uygun bir seyreltmeden sonra bir hemositometre kullanarak pelet içindeki hücreleri ölçün
.
- Tohum, 40.000 hücre /cm2 yoğunluğunda hücreleri, bir MSC büyüme ortamında 10 cm'lik bir kültür plakasına geçirdi.
not: Sıçan MSC'leri, geçişten sonraki 2 gün içinde% 80-90 birleşmeye ulaşmalıdır (Şekil 1B). Hücreler, adım 1.2.2'de açıklandığı gibi 8 geçişe kadar geçirilebilir. MSC'ler, immünositokimya ve trilineage farklılaşma kapasiteleri kullanılarak karakterize edilebilir (Şekil 2). Sadece pasaj 3 ve 8 arasındaki MSC kültürleri, müteakip hipoksik ön koşullandırmaya ve nöral progenitör zenginleştirmesine tabidir. Daha büyük geçiş sayısına sahip MSC'ler düzleştirilmiş bir morfoloji benimser (Şekil 1C) ve yeterli nöral progenitör üretmez. Bu kültürler atılmalıdır.
2. İnsan BMSC Kültürlerinin Hazırlanması
- 1 mL insan kemik iliği aspiratını 9 mL MSC büyüme ortamı ile seyreltin ve hücreleri 10 cm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Kültürleri bir hücre inkübatöründe tutun (37 ° C,% 5 CO2).
- Ortamı 2 gün sonra çıkarın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için kültürleri 10 mL PBS ile üç kez nazikçe durulayın. Son durulamadan sonra, PBS'yi çıkarın ve 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirin. PBS durulamasından sonra her 3 günlük kültürden sonra büyüme ortamını yenileyin.
not: MSC kolonileri 6-7. günde görünür olmalıdır. Koloni sayısı denekler arasında değişebilir.
- Hücreleri adım 1.2.2'de açıklandığı gibi 10. günde geçirin. PBS'de uygun bir seyreltmeden sonra bir hemositometre kullanarak pelet içindeki hücreleri ölçün. Geçen hücreleri 40.000 hücre /cm2 yoğunlukta bir MSC büyüme ortamında 10 cm'lik bir kültür plakasına tohumlayın.
not: İnsan MSC'leri (Şekil 1D), sıçan MSC'lerine benzer bir morfoloji gösterir ve geçişten sonraki 2 gün içinde% 80-90 birleşmeye ulaşmalıdır. İmmünositokimya ve trisoy farklılaşması kapasiteleri kullanılarak karakterize edilmelidirler. Sıçan MSC'lerinde olduğu gibi, 3. ve 8. pasajlar arasındaki insan MSC'leri, müteakip hipoksik ön koşullandırmaya ve nöral progenitör zenginleştirmesine tabidir.
3. Hipoksik Ön Koşullandırma
- Halka kelepçeyi serbest bıraktıktan sonra hipoksi odası bileşenlerini (yani taban, kapak, tepsiler) sökün ve tek tek parçaları %70 etanol ile temizleyin. Hazne bileşenlerini, UV ışığı altında 15 dakika boyunca sterilizasyon için laminer akışlı bir doku kültürü başlığına yerleştirin.
- Hipoksik ön koşullandırmadan önce, ortamı çıkarın ve sıçan ve insan MSC kültürlerini (bölüm 1 ve 2) 10 mL PBS ile durulayın. PBS'yi 25 mM HEPES.
ile desteklenmiş 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirin
not: 10 cm'lik tabaklar üzerinde kültürlenen MSC'ler, hipoksik ön koşullandırmaya tabi tutulmadan önce% 80-90 birleşmeye ulaşmış olmalıdır.
- Kültür kaplarını hipoksi odasına yerleştirin. Hazne bileşenlerini yeniden monte edin ve halka kelepçesini sıkın. %99 N2/1% O2 içeren bir gaz karışımını 5 dakika boyunca 10 L / dk akış hızında hazneye yıkayın.
- Gaz sızıntısı olmamasını sağlamak için hipoksi odasının bağlantı uçlarını kapatın. Hazneyi 16 saat boyunca hücre inkübatörünün (37 °C,% 5 CO2) içine yerleştirin.
- Hipoksik ön koşullandırmanın tamamlanmasının ardından, sonraki nöral progenitör zenginleştirme kültürüne hazırlık olarak kültürleri odadan çıkarın.
4. Nöral Progenitör Zenginleştirme Kültürü
- B27 (% 2 v / v), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng / mL), epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı / Ham'ın besin karışımı F12'den (DMEM / F12) oluşan nöral progenitör ortamı hazırlayın.
- Adım 1.2.2'de açıklandığı gibi hipoksik ön koşullandırılmış sıçan / insan MSC'lerini ayırın. Ayrılan hücreleri 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile toplayın. PBS'de uygun seyreltmeden sonra bir hemositometre kullanarak pelet içindeki hücreleri ölçün.
- Nöral progenitör ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin ve 6.000 hücre /cm2 yoğunluğunda düşük bağlı, 6 oyuklu plakalar üzerinde tohumlayın. Kültürü 12 gün boyunca bir hücre inkübatörüne (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin. Nöral progenitör ortamının %75'ini her 3 günde bir yenileyin.
not: Büyük yapışık olmayan hücre kümeleri 6-7. günlerde gözlenmelidir. 10-12. günlerde, çapı 100 μm ≥ nörosferler gözlenebilir (Şekil 3). Hipoksik ön koşullandırılmış MSC'ler, normoksik koşullar altında kültürlenen MSC'lerden daha fazla nöroküre vermelidir.
- 12. günde nöroküreleri 10 mL'lik bir pipete aspire ederek ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktararak toplayın. Nörosferleri 5 dk.
boyunca 250 x g'da santrifüjleyin
not: Nörosferler, nestin ve GFAP gibi nöral progenitör belirteçler için 12. günde karakterize edilebilir.
5. Schwann hücresi benzeri hücrelerin oluşumu
- β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (% 10) ve P / S (% 1 v / v) ile desteklenmiş αMEM'den oluşan glial indüksiyon ortamı hazırlayın.
- Bölüm 4'te hazırlanan nöroküreleri, oyuk başına 1.5 mL glial indüksiyon ortamında cm başına 5-10 küre yoğunlukta PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalarda 2 plaka. Hücreleri PBS.
ile duruladıktan sonra glial indüksiyon ortamını her 2 günde bir değiştirin
not: Tohumlanmış nörokürelerden gelen hücrelerin 2. güne kadar dışarıya doğru göç ettiği görülmektedir. 7. günde, göçmen hücreler konik bir görünüme sahiptir ve Schwann hücre belirteçleri p75 nörotrofin reseptörü (p75) ve S100β için immünopozitiflik göstermelidir. Bu hücreler SCLC'ler olarak adlandırılır.
