DRG Nöronları ile Kokültür Yoluyla Kader Taahhütlü Schwann Hücrelerinin Üretilmesi
1. Saflaştırılmış sıçan DRG nöronlarının hazırlanması
- Tüm diseksiyon aletlerini (yani diseksiyon makası, forseps, iki mikrodiseksiyon forsepsi ve mikrodiseksiyon makası) kullanmadan önce en az 2 saat boyunca 180 °C'de otoklavlayın.
- 6 oyuklu doku kültürü plakalarını gece boyunca 4 ° C'de poli-D-lizin (PDL, PBS'de 10 μg / mL) ile kaplayın. PDL'yi çıkarın ve oyuk başına 1,5 m PBS ile durulayın.
- Plakaları laminin ile (PBS'de 10 μg/mL) 37 ° C'de 2 saat boyunca kaplamaya devam edin. Plakaları oyuk başına 1.5 mL PBS ile durulayın.
- B27 (%2 v/v), L-glutamin (%1 v/v), sinir büyüme faktörü (NGF, 20 ng/mL) ve penisilin/streptomisin (P/S, %1 v/v) ile takviye edilmiş nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron bakım ortamını hazırlayın.
- B27 (% 2 v / h), L-glutamin (% 1), sinir büyüme faktörü (NGF, 20 ng / mL), P / S (% 1), florodeoksiüridin (FDU, 10 μg / mL) ve üridin (10 μg / mL) ile takviye edilmiş nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron saflaştırma ortamını hazırlayın.
- Gebe sıçanları 14-15 gebelik gününde pentobarbital doz aşımı (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal) ile sakrifiye edin.
- Kesilen kurbanları sırtüstü pozisyona getirin. Karınlarını %70 etanol ile iyice temizleyin.
- İnce diseksiyon makası ve forseps kullanarak hayvanın alt karın duvarını uzunlamasına kesin. Diseksiyon makası kullanarak uterusu tanımlayın ve çıkarın. Embriyoları ortaya çıkarmak ve çıkarmak için rahim duvarını kesin. Embriyoları PBS ile doldurulmuş steril, 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın. Kültür kabını buzun üzerine yerleştirin.
- Diseksiyon amaçlı embriyoyu PBS (oda sıcaklığı) ile doldurulmuş steril, 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın ve diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Embriyoyu yüzüstü pozisyonda bulundurun.
not: Beyazımsı omurilik ve bağlı DRG'ler, yarı saydam derisi aracılığıyla embriyonun dorsal yönü üzerinde görülebilir.
- Omuriliğin her iki tarafına mikrodiseksiyon forsepsleri yerleştirin ve omuriliği çevreleyen yumuşak dokudan ayırmaya başlamak için künt diseksiyon kullanın. Boyun açıklığı ve kuyruk saplaması boyunca mikrodiseksiyon forsepsleri kullanarak omuriliği hayvandan serbest bırakın. Kordonu çevreleyen yumuşak dokudan kurtarmak için kordonun ventral yönü üzerinde daha fazla künt diseksiyon yapın.
- Serbest kalan omuriliğin dorsal yüzü üzerindeki artık yumuşak dokuyu çıkarmak için mikrodiseksiyon forsepsleri kullanın.
not: Bu aşamada sadece omurilik, sinir kökleri ve bağlı DRG kalmalıdır.
- Mikrodiseksiyon forsepsleri kullanarak tek tek DRG'leri bağlantı sinir köklerinden ayırın. DRG'leri PBS.
içeren 1,5 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL'lik bir uca bağlı bir pipet kalemi kullanın
not: Her 1,5 mL'lik tüp için maksimum 100 DRG yerleştirilebilir.
- DRG'leri 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifi (tüp başına 200 μL) içinde yeniden süspanse edin. (37 °C,% 5 CO2) 10 dakika inkübe edin. DRG'leri 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve DRG nöron bakım ortamında yeniden süspanse edin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak peleti nazikçe ezerek ayırın. Uygun bir seyreltmeden sonra bir hemositometre kullanarak pelet içindeki hücreleri ölçün.
- Hücreleri 5.000 hücre /cm2 yoğunluğunda, oyuk başına 1.5 mL DRG nöron bakım ortamında PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara tohumlayın. İki günlük kültürden sonra, DRG nöron bakım ortamını çıkarın, PBS ile durulayın ve DRG nöron saflaştırma ortamı ile değiştirin.
not: Her saflaştırma döngüsü için, DRG kültürlerini 2 gün boyunca saflaştırma ortamı ile muamele edin, ardından bakım ortamında 1 gün inkübasyon yapın. 3-4 saflaştırma döngüsünden sonra, tüm endojen gliaların çıkarılması beklenir. Bu yaklaşık 14 gün sürmelidir. Saflaştırılmış kültürler, nöronal belirteç TUJ1 için pozitif test eder ve S100β ekspresyonu için yoktur (Şekil 1).
2. Schwann hücresi benzeri hücrelerin oluşumu
- β-Heregulin (100 ng / mL), bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 10 ng / ml), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA, 5 ng / mL), fetal sığır serumu (FBS,% 10) ve P / S (% 1 v / v) ile desteklenmiş αMEM'den (Minimum esansiyel ortam Eagle (MEM), alfa modifikasyonları) oluşan glial indüksiyon ortamı hazırlayın.
- Bölüm 4'te hazırlanan nöroküreleri, oyuk başına 1.5 mL glial indüksiyon ortamında cm2 başına 5-10 küre yoğunluğunda PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalarda plakalayın. Hücreleri PBS ile duruladıktan sonra her 2 günde bir glial indüksiyon ortamını değiştirin.
- NOT: Tohumlanmış nörokürelerden gelen hücrelerin 2. güne kadar dışarıya doğru göç ettiği görülmektedir. 7. günde, göçmen hücreler konik bir görünüme sahiptir ve Schwann hücre belirteçleri p75 nörotrofin reseptörü (p75) ve S100β7 için immünopozitiflik göstermelidir. Bu hücreler SCLC'ler olarak adlandırılır.
3. SCLC'lerin DRG nöronları ile kokültürü
- DRG nöron bakım ortamından (adım 1.1.4) ve glial indüksiyon ortamından (adım 1.2.1) oluşan kokültür ortamını 1: 1 hacim-hacim oranında hazırlayın.
- FBS (% 5), β-Heregulin (10 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı F-12'den (DMEM / F12)) oluşan Schwann hücre bakım ortamını hazırlayın.
- Kültür ortamını 7. gün SCLC'lerinden çıkarın, PBS ile durulayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca 0.5 mL / kuyu rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin. SCLC'leri kokültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Uygun bir seyreltmeden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün.
- SCLC'leri 1.000 hücre /cm2 yoğunlukta saflaştırılmış DRG nöron kültürlerine tohumlayın. Kokültürleri 14 gün boyunca koruyun, her 2 günde bir orta değiştirme ile.
not: Kokültür sırasında, SCLC'ler olgun Schwann hücrelerinin tipik özelliği olan iğ benzeri morfolojiyi elde etti (Şekil 2). Bu hücreler, büyüme faktörlerinin geri çekilmesinden sonra fenotiplerinde kalırlar ve in vitro ve in vivo olarak aksonları miyelinleyebilirler. Schwann hücre belirteçlerinin pozitifliği (ör., p75 ve S100β) immünofloresan ile izlenmelidir.
- Kokültürün tamamlanmasının ardından, kadere bağlı Schwann hücrelerini geçer. Kuyucuk başına 0.5 mL ayrışma reaktifi kullanın. Uygun bir seyreltmeden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün.
