$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Agaroz Hidrojel Mikro Kolonlarının Geliştirilmesi
- 3 g agarozu tartarak ve 100 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) içeren steril bir behere aktararak% 3 ağırlık / hacim (a / h) çözeltisi yapın. Behere steril bir manyetik çubuk ekleyin ve bir sıcak plakanın/karıştırıcının yüzeyine yerleştirin. Bir sonraki adımda içeriğinin buharlaşmasını önlemek için kabı kapalı tutun.
- Agaroz ve DPBS'yi 100 °C sıcaklıkta ısıtın ve 60-120 rpm'de karıştırın. Bu ayarları gerektiği gibi ayarlayın ve çözelti başlangıçta opaktan agarozun tamamen çözündüğünü gösteren net bir görünüme dönüşürken çözünme işleminin ilerlemesini sürekli olarak izleyin.
Dikkat: Sıcak beher ve çözelti sıcak!
- Agaroz çözeltisi ısıtılırken ve karıştırılırken, dört adet boş 10 cm'lik Petri kabı alın ve ikisine 20 mL DPBS ekleyin. Akupunktur iğnelerini (çap: 300 μm, uzunluk: 40 mm), cam mikrolitre kılcal tüpleri (çap: 701,04 μm, uzunluk: 65 mm, kapasite: 25,0 μL) ve bir ampul dağıtıcısını biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin. Sıvı agaroz çözeltisi temizlendiğinde, agarozun jelleşmesini önlemek için yaklaşık 50 °C'de sabit ısıtmayı ve karıştırmayı sürdürün.
- Bir ampul dağıtıcısının alt açıklığına bir akupunktur iğnesi sokun. Dışarıya maruz kalan iğnenin üzerine bir kılcal boru yerleştirin. Kılcal boruyu, bir kısmını ampul dağıtıcı silindirinin kauçuk kısmına girerek sabitleyin.
- 1 mL sıvı agarozu bir mikropipet ile boş bir Petri kabının yüzeyine aktarın ve ampul dağıtıcısının lastik kapağı içeri doğru sıkıştırılırken kılcal borunun bir ucunu dikey olarak (iğne takılıyken) agarozla temas edecek şekilde yerleştirin. Agarozu kılcal boruya çekmek için ampul dağıtıcı kapağındaki basıncı yavaşça boşaltın.
not: Sıvı agarozun kılcal borulara transferi hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Sıvı agaroz Petri kabı yüzeyinde yeterli süre (yaklaşık 60 s) soğumaya bırakılırsa, jelleşmeye başlar ve agarozun kılcal boru boyunca uygun şekilde emilmesini önler.
- Her bir ampul tüpü-iğne tertibatını serbest bir Petri kabına yerleştirin ve kılcal tüplerin içindeki agaroz jelin 5 dakika katılaşmasına izin verin. Kılcal boruyu ellerinizle ampul dağıtıcı silindirindeki lastik tıpadan dikkatlice dışarı çekin, iğneyi ve agaroz jeli tüpün içinde yerinde bırakın.
- Akupunktur iğnesini kılcal borudan yavaşça çekerek manuel olarak çıkarın; Yeni katılaşmış agaroz silindiri de bu prosedürde tüpten dışarı kayar ve hala iğneyi çevreler. Mikro sütunu akupunktur iğnesi boyunca steril forsepsin ucuyla yavaşça iterek sonuna kadar hareket ettirin. İğneyi açık, DPBS içeren bir Petri kabının üzerine yerleştirin ve mikro sütunu forseps ile DPBS'ye itin.
not: Akupunktur iğnesi çıkarıldıktan sonra agaroz mikro kolon cam kılcal tüpün içinde kalırsa, agaroz mikro kolonunu 25 mm'lik bir ölçü iğnesi ile yavaşça kılcal tüpten dışarı ve DPBS ile tabağa itin.
- Sıcak boncuk sterilizatörü kullanarak mikro neşterleri veya forsepsleri sterilize edin. 4 g agarozu tartarak ve 100 mL DPBS'ye aktararak% 4 w / v agaroz yapın. Berrak bir %1.2 sıvı agaroz çözeltisi elde etmek için adım 4'de açıklandığı gibi ısıtın ve karıştırın. Aşağıdaki adımlar boyunca çözeltinin ısıtılmasını ve karıştırılmasını sağlayın.
- Mikro sütunları içeren Petri kaplarını bir diseksiyon başlığına aktarın ve ince forsepsli bir mikro sütunu boş bir Petri kabına taşıyın. Görsel rehberlik için stereoskopu ve mikro sütunları istenen uzunlukta kesmek için bir mikro neşter kullanın. Hücre dışı matris (ECM) ve hücre ilavesi sırasında mikro sütunların işlenmesini kolaylaştırmak için yataydan 45o açıyla eğimli uçlar oluşturmak için her iki ucu da kesin.
- Aynı Petri kabındaki üç mikro sütun için önceki adımı tekrarlayın ve silindirlerin her biri arasında <3 mm'lik bir mesafe ile dört yapıyı paralel olarak hizalayın. Bir mikropipet ile 50 μL% 4 agaroz çözeltisi yükleyin ve yapıları dörtlü gruplar halinde bağlamak ve demetlemek için mikro sütun dizisinin üzerine bir çizgi/sıvı hattı dökün (bundan böyle "mikro sütunlu tekneler" olarak anılacaktır). Yapılar arasındaki mesafeyi en aza indirerek ve agarozu ince bir çizgi halinde hızlı bir şekilde ekleyerek, iç kısmı tıkayabilecek %4'lük agarozun mikro sütunların uçlarına doğru hareket etmesini önleyin.
not: Astrositik iskeleleri imal etmek için dört mikro sütundan oluşan grupları "tekneler" halinde düzenlemek gerekli değildir. Bununla birlikte, tekneler imalat sürecini hızlandırmaya ve daha sonraki adımlarda mikro sütunları taşımak ve işlemek için daha güvenli bir yol sunmaya hizmet eder.
- Eklenen %4'lük agarozun jelleşmesine izin vermek için mikro sütunlu tekneyi 1-2 dakika soğumaya bırakın. %4'lük agarozu bağlayarak ince forsepsli mikro sütunlu tekneyi alın ve mikro sütunları adım 1.1.3'te hazırlanan diğer DPBS içeren Petri kabına taşıyın. Kalan mikro sütunlarla istediğiniz gibi daha fazla tekne üretin.
- Mikro sütunları ve/veya tekneleri içeren Petri kaplarını bir biyogüvenlik kabinine taşıyın ve 30 dk.
boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakarak sterilize edin
Dikkat: UV'ye maruz kalmayı önlemek için uygun koruma kullanın.
- Mikro kolonlu teknelerle bulaşıkları DPBS'de 4 °C'de, ECM ilavesi ve hücre kaplaması hemen ardından gerçekleşmezse, 1 haftaya kadar saklayın. Yapılar bu zaman dilimi boyunca kullanılmazsa mikro sütun üretim adımlarını tekrarlayın.
2. Birincil Hücre Kültürü ve İzolasyonu
- Sıçan yavrularından kortikal astrosit izolasyonu
- Aşağıdaki adımlara hazırlık olarak, diseke edilen dokular için rezervuar görevi görecek dört adet 10 cm'lik Petri kabına 20 mL Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ekleyin. Tüm bulaşıkları buz üzerinde tutun. Temiz cerrahi makasları, forsepsleri, mikro spatulaları ve mikro neşterleri sıcak boncuk sterilizatöründe sterilize edin.
- 37 ° C'de HBSS'de 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 0.15 mg / mL deoksiribonükleaz (DNaz) I ile% 0.25 tripsin ön ısıtın. Ek olarak, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile Ham'ın F-12 Besin Karışımı ve% 10 fetal sığır serumundan (FBS) oluşan astrosit kültür ortamını 37 ° C'de önceden ısıtın.
- Doğum sonrası 0. gün veya 1. gün Sprague-Dawley sıçan yavrularını hipotermik koşullara maruz bırakarak uyuşturun ve dekapitasyon ile ötenazi yapın. Gözlerin önündeki burun içine yerleştirilmiş 19 mm'lik bir ölçü iğnesi kullanarak kafayı bir sahneye sabitleyin.
- Neşter ile ortanın arkasından öne, boynun tabanından gözlerin hemen arkasına kadar bir kesi yapın. Gözlerin hemen arkasından aşağıya doğru yanal olarak giden ve bir T şekli oluşturan başka bir kesi yapın. Kafatası derisini/kafatasını yana doğru çekmek için ince forseps kullanın.
- Forsepsin bir ucunu hayvanın ağzına ve diğerini dış yüzeye yerleştirerek başı burnundan (yukarı bakacak şekilde) tutun. Beyni steril bir mikro spatula ile çıkarın ve soğutulmuş HBSS ile doldurulmuş Petri kaplarından birine yerleştirin. Bu Petri kabını hemen ardından ve kullanım dışında her zaman buzun üzerine yerleştirin.
- Daha önce -20 °C'de saklanan bir granit bloğu bir stereoskopun altına bir diseksiyon başlığının içine yerleştirin. Diseksiyon işlemi sırasında düşük sıcaklığını korumak için Petri kabını beyin dokusuyla birlikte granit bloğun yüzeyine yerleştirin. Aşağıdaki adımlar boyunca stereoskopu görsel kılavuz olarak kullanın.
- Koku soğancıkları sağlam kalırsa, forseps veya mikro neşter ile keserek çıkarın. Ek olarak, beyinciği çıkarmak ve iki serebral hemisferi ayıran orta hat kesisi yapmak için bir mikro neşter kullanın. Yarım küreleri forseps ile taze, soğutulmuş HBSS içeren bir Petri kabına aktarın.
- Sadece ayrılmış korteksleri elde etmek için orta beyin yapılarını yarım kürelerin içinden bir mikro neşter ile inceleyin. Tabaka benzeri bir yapı olan meninksleri kortikal dokudan soymak ve izole korteksleri soğuk HBSS ile yeni bir Petri kabına aktarmak için ince forseps kullanın. Bir sonraki adımda tripsin etkisi için yüzey alanını artırmak amacıyla dokuyu kıymak için mikro neşter kullanın.
- Korteksleri 4 mL önceden ısıtılmış tripsin-EDTA (her tüpte 8 korteks) içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Kortikal dokuyu 37 ° C'de 5-7 dakika boyunca tripsin-EDTA'ya maruz bırakın.
- Bir Pasteur pipeti ile tripsin-EDTA'yı dikkatlice çıkarın ve santrifüj tüpüne 400 μl 0.15 mg / mL DNAse I çözeltisi ekleyin. Tüm doku ayrışana ve sıvıda kalan doku parçası kalmayana kadar tüpü veya vorteksi çalkalayın. Dokuyu tamamen çözmek mümkün değilse, kalan parçaları bir Pasteur pipetinin ucuyla çıkarın.
- Ayrışmış hücre çözeltisini içeren tüpü 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri rahatsız etmeden süpernatanı bir Pasteur pipeti ile çıkarın. Bir mikropipet ile tüpe 1 mL astrosit kültür ortamı (adım 2.1.2'de tanımlanmıştır) ekleyin ve yeniden süspanse etmek ve homojen bir çözelti oluşturmak için çalkalayın.
- Serolojik bir pipet ile 10 mL astrosit kültür ortamını bir T-75 şişesine aktarın. 250 μl'lik 1 mL hücre çözeltisi (adım 2.1.11'de hazırlanmıştır) bir mikropipet ile şişeye ekleyin ve şişe başına bir yavru beyin değerinde hücre yerleştirin. Taburcu edilen hücre çözeltisini kültür ortamı boyunca eşit olarak dağıtın ve eşit bir dağılımı daha da teşvik etmek için şişeyi hafifçe çalkalayın.
- Kaplanmış şişeleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de kültürleyin. Kültürde 24 ve 72 saate ulaştıktan sonra, nöronlar ve oligodendrositler gibi yapışmayan hücre tiplerini ayırmak için şişeyi mekanik olarak çalkalayın.
- Daha sonra, bu zaman noktalarının her birinde bir medya değişikliği gerçekleştirin. Şişeyi dikey olarak tutun, böylece kültür ortamı şişenin dibinde kalır, yapışan hücreleri örtmez. Hücrelerin çıkarılmasını önlemek için pipetin ucunu şişenin alt köşesine bastırarak kültür ortamını bir Pasteur pipeti ile aspire edin. Şişeyi orijinal yatay konuma yerleştirin ve serolojik bir pipetle hücrelerin üzerine nazikçe 10 mL astrosit ortamı ekleyin.
- Her ortam değişiminden sonra şişeleri inkübatöre geri koyun. % 90 birleşme elde edildikten sonra, kalan yapışmayan hücreleri çıkarmak için şişeyi bir kez daha mekanik olarak çalkalayın.
- Kültür ortamını bir vakum ve bir Pasteur pipeti ile çıkararak astrositleri geçirin. Yapışan hücrelerin üzerine serolojik bir pipet ile 5 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Tripsinin tüm hücreleri kapladığından emin olmak için şişeyi hafifçe çalkalayın ve şişeyi 37 ° C ve% 5 CO2'de 5-7 dakika inkübe edin.
- Serolojik bir pipet ile hücrelere 1 mL astrosit ortamı ekleyerek tripsin söndürün. Hücre çözeltisini şişeden serolojik bir pipetle çıkarın ve steril bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı serolojik bir pipetle çıkarın ve 1 mL astrosit kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücre çözeltisinin homojen olduğundan emin olmak için tüpü çalkalayın. Çözeltideki hücre sayısını bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın.
not: %90 birleşik olan bir şişe tipik olarak yaklaşık 3 milyon astrosit verir.
- Bir T-75 şişesine 10 mL astrosit kültür ortamı ekleyin. 250 μl hücre çözeltisini (adım 2.1.18) bir mikropipet ile halihazırda kültür ortamı içeren T-75 şişesine aktararak 1:4 seyreltme gerçekleştirin. Şişenin yüzeyi boyunca homojen bir hücre dağılımı sağlamak için hafifçe çalkalayın.
- Hücrelerden geçmek için %90 birleşme sağlandığında 2.1.16-2.1.19 adımlarını tekrarlayın.
- Sıçan Fetüslerinden Kortikal Nöron İzolasyonu
- Önceden ısıtılmış ortamın Nörobazal ortam +% 2 B-27 takviyesi (nöronlar için) +% 1 G-5 serumsuz takviyesi (astrositler için) +% 0.25 L-glutamin'den oluşan ko-kültür ortamı olması dışında, 2.1.1 ve 2.1.2 adımlarına benzer hazırlıkları izleyin.
- Zamanlanmış gebe embriyonik gün 18 Sprague-Dawley sıçanlarını karbondioksit asfiksiasyonu ile ötenazi yapın ve dekapitasyon ile ölümü onaylayın.
- Sıçan fetüslerini çıkarın ve görsel rehberlik için bir stereoskop ve sterilize makas, mikro neşter ve forseps kullanarak, soğutulmuş granit bloğun yüzeyinde HBSS içeren Petri kaplarındaki serebral dokunun geri kalanından korteksleri inceleyin. Kafaların, beyinlerin, serebral hemisferlerin ve kortekslerin art arda diseksiyonundan sonra, her dokuyu yeni bir HBSS dolu Petri kabına aktarın.
- Tripsin için yüzey alanını artırmak için kortikal dokuyu daha küçük parçalara ayırın. 4-6 korteksi bir Pasteur pipeti ile 5 mL önceden ısıtılmış tripsin-EDTA içeren bir tüpe aktarın ve dokuyu ayırmak için 37 ° C'de tutun. 5-7 dakikada, dokunun topaklanmasını önlemek ve karıştırmak için tüpü manuel olarak çalkalayın.
- Tüpü 10 dakika sonra 37 °C'den çıkarın. Daha önce adım 2.1'de açıklandığı gibi, tripsin-EDTA'yı ekstrakte edin ve 1.8 mL 0.15 mg / mL DNAse çözeltisi ile değiştirin. Daha sonra, çözelti homojen görünene kadar dokuyu girdap haline getirin ve sıvıda yüzen doku parçası kalmaz.
- Ayrışmış doku çözeltisini 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 2 mL ko-kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bu çözeltideki hücre sayısını bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın.
not: Normal verim 3.0-5.0 x 106 hücre / kortikal hemisferdir.
- Yukarıda tanımlanan ko-kültür ortamında 2.0-4.0 x 105 hücre/mL yoğunluğa sahip yeni bir hücre çözeltisi hazırlayın.
3. Mikro Sütunların İçindeki Astrositik Kabloların Geliştirilmesi
- ECM çekirdek imalatı
NOT: ECM, hücre tohumlamanın yapılacağı gün hidrojel mikro kolonların iç kısmına eklenmelidir.
- Bir biyogüvenlik kabininin içinde, steril bir mikrosantrifüj tüpünde ko-kültür ortamında 1 mg / mL'lik bir sıçan kuyruğu tip I kollajen çözeltisi hazırlayın. ECM solüsyonu ile mikrosantrifüj tüpünü kullanım dışında her zaman buz üzerinde tutun.
- PH'ını tahmin etmek için ECM çözeltisinin 1-2 μL'sini bir mikropipet ile bir turnusol kağıdı şeridine aktarın. ECM çözeltisinin pH'ını artırmak veya azaltmak için sırasıyla 1 μL 1 N sodyum hidroksit (NaOH) veya hidroklorik asit (HCl) bir mikropipet ile ekleyin ve homojenize etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Yeni pH'ı bir turnusol kağıdı şeridi ile doğrulayın ve pH 7.2-7.4 aralığında stabil olana kadar gerektiği kadar daha fazla asit veya baz ekleyin.
- Petri kaplarını adım 1.2'den bir diseksiyon başlığına taşıyın ve 4-5 mikro sütunu veya steril ince forsepsli bir tekneyi boş, steril 35 veya 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Yönlendirme için stereoskopu kullanarak, bir mikropipetin 10 μL'lik ucunu her mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve DPBS ve hava kabarcıklarının lümenini boşaltmak için emdirin. Bir sonraki adımda eklenen ECM'nin lümen boyunca serbestçe akabilmesini sağlamak için stereoskop ile hava kabarcıklarının olmadığını onaylayın.
- Bir P10 mikropipeti ECM solüsyonu ile şarj edin, 10 μL'lik ucu hidrojel mikro sütunların bir ucuna yerleştirin ve stereoskop ile ECM girişini gözlemleyerek lümeni doldurmak için yeterli solüsyonu (yaklaşık 3-5 μL) verin. Mikro sütunun her iki ucuna küçük bir rezervuar (2-4 μL) ECM solüsyonu pipetleyin.
not: Mikro sütun yapısının buruşmasına neden olabileceğinden, yapıların uzun süre kurumasını önlemek için her zaman 4-5 mikro sütunu veya bir seferde bir tekneyi yönetin. Tamamen kurutulmuş mikro sütunlar, Petri kaplarının yüzeyine sıkıca yapışır ve bu da hücre tohumlama için kullanılmalarını önler. Mikro sütunlara aşırı miktarda ko-kültür ortamı (hidrasyon önlemi olarak) eklenemez, çünkü bu, aşağıda açıklanan inkübasyon süresi boyunca ECM'nin dışarı akmasına neden olabilir.
- İnkübasyon sırasında kolonların kurumasını önlemek için bir nem emici sağlamak üzere Petri kabının etrafındaki bir halka halinde ko-kültür ortamını pipetleyin. Nöronları ve/veya astrositleri eklemeden önce kollajenin polimerizasyonunu teşvik etmek için ECM içeren mikro kolonları içeren Petri kabını 37 °C ve %5CO2'de 1 saat inkübe edin.
not: ECM, her ikisi de stereoskop kullanılarak gözlemlenebilen, iç kısmı saran katı bir ECM çekirdeği yerine, içi boş lümenin iç yüzeyini kaplayan bir tabaka oluşturmalıdır. ECM bir çekirdek oluşturuyorsa, sadece katman kalana kadar kuluçka dönemine devam edin. Bu tabaka oluştuğunda, astrosit hücre çözeltisi, kaplama adımlarında mikro kolonun içini doldurabilir.
- Kuluçka süresi boyunca, astrosit hücre çözeltisini hazırlayın (aşağıda tarif edildiği gibi).
- Mikro sütunlarda astrosit ve nöron tohumlanması
- Kaplanmış astrositleri (dördüncü ve on ikinci geçiş arasında) adım 2.1.16-2.1.19'da açıklandığı gibi geçirin. Şişedeki hücre sayısını saydıktan sonra, hücre kültürü ortamında süspanse edilmiş 9.0-12.0 x 105 hücre/mL çözelti yoğunluğunda hücre çözeltisi hazırlayın.
- Bir stereoskop kullanarak, bir P10 mikropipetinin ucunu mikro sütunların bir ucuna yerleştirin ve tamamen doldurmak için lümene yeterli hücre çözeltisini (~ 5 μL) aktarın. Yukarıda ECM ile yapıldığı gibi, her bir mikro sütunun her iki ucuna küçük hücre çözeltisi rezervuarları ekleyin.
- Astrositlerin ECM'ye bağlanmasını teşvik etmek için Petri kapları üzerindeki kaplanmış mikro sütunları 37 °C ve %5CO2'de 1 saat inkübe edin. Nöronlar mikro sütunlara eklenmeyecekse, adım 3.2.5'e geçin.
- İlk inkübasyon dönemini takiben, 2.2.7 adımında elde edilen kortikal nöron solüsyonundan 1-2 μL'yi bir mikropipet ile mikro kolonların her iki ucuna stereoskop altında gözlem yaparak ekleyin. Kurumasını önlemek için bulaşıklarda yeterli ortam bulunduğundan emin olun ve nöronların yapışmasını sağlamak için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 40 dakika tekrar inkübe edin.
not: Kortikal nöron çözeltisi, demet oluşumundan 1-2 gün sonra, kültür ortamını Petri kabından bir mikropipet ile dikkatlice çıkardıktan sonra adım 3.2.4'ü gerçekleştirerek de eklenebilir.
- Kuluçka süresinden sonra, kaplanmış mikro sütunları içeren Petri kaplarını, sırasıyla 35 veya 60 mm Petri kapları için 3 veya 6 mL ko-kültür ortamı ile dikkatlice doldurun. 6-10 saat sonra demetlenmiş, kablo benzeri bir yapı oluşturması gereken hizalanmış astrositik demetlerin kendi kendine montajını teşvik etmek için kaplanmış mikro sütunları kültürde 37 ° C ve% 5 CO2'de tutun.