$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İpek İskele Hazırlığı
- Bombyx mori kozalarından ipek çözeltisinin hazırlanması
- Her kozayı makas kullanarak 8 eşit parçaya kesin. 5 g parçalanmış koza için yaklaşık 11 koza kullanın. (15 dk)
- 2 L 0.02 M Na2CO3 çözeltisi hazırlayın ve sıcak bir plaka kullanarak kaynatın. (15 dk)
- 5 g parçalanmış kozayı tartın veNa2CO3 çözeltisinde 30 dakika kaynatın. Kaynayan ipeği birkaç dakikada bir spatula ile karıştırın. De-gumming adı verilen bu adım, ipek fibroini hidrofilik proteinlerden, serisinlerden arındırır. (30 dk)
- Fibroini elinizle sıkın ve kalan serisin ve kimyasalları yıkamak için en az üç kez damıtılmış suda durulayın. (5 dk)
- Islak fibroini bir petri kabına yerleştirin ve fibroin ekstraktını akış başlığı O/N'de kurutun.
- Ertesi gün, kuru fibroin kütlesini tartın ve fibroini bir cam kabın içine yerleştirin. (15 dk)
- Fibroini 9.3 M LiBr çözeltisinde çözmek için, kuru fibroin kütlesini 4 ile çarparak gerekli LiBr hacmini (ml cinsinden) hesaplayın. LiBr solüsyonunu ipek fibroinin üzerine yavaşça dökün ve tüm fibroin liflerini daldırmak için bir spatula kullanın. Buharlaşmayı önlemek için kabı örtün ve liflerin çözünmesini sağlamak için 4 saat boyunca 60 °C'ye koyun. (15 dk)
- Şırıngayı kullanarak, fibroin çözeltisini beherden toplayın ve MWCO 3.500 diyaliz kasetlerine yükleyin. 48 saat boyunca damıtılmış suya karşı diyaliz yapın. Suyu birkaç saatte bir değiştirin.
- Şırıngayı kullanarak, fibroin çözeltisini kasetlerden 50 ml'lik konik tüplere toplayın ve 20 dakika boyunca 4 ° C'de 9.000 rpm'de (~ 12.700 x g) iki kez santrifüjleyin. Her santrifüjleme adımından sonra, süpernatanı yeni bir tüpe dökün ve peleti atın. (40 dk)
- Kuru ağırlığı tahmin ederek fibroin konsantrasyonunu ölçün. Bir tartı teknesine 1 ml ipek çözeltisi dökün. Numuneyi 60 °C'de 2 saat fırında kurutun. Kuru ipek fibroini tartın ve elde edilen ağırlığı 100 ile çarparak ipek fibroin çözeltisinin konsantrasyonunu hesaplayın. Beklenen ipek çözeltisi konsantrasyonu %6-9'dur (a/h).
- Damıtılmış suda seyrelterek ipek konsantrasyonunu %6'ya (a/h) ayarlayın.
Durma noktası: Sıvı ipek fibroin, kapalı bir kapta bir aya kadar 4 °C'de saklanabilir.
- İpek çözeltisinden gözenekli iskelelerin hazırlanması.
- Daha sonraki adımlarda kullanılacak olan 500-600 μm granülleri ayırmak için granül NaCl'yi eleyin. 500 μm'nin altında ve 600 μm'nin üzerindeki granülleri atın. (15 dk)
- Politetrafloroetilen (PTFE) kalıba 30 ml% 6 ipek çözeltisi dökün (Şekil 1). İpeğin üzerine 60 g elenmiş NaCl'yi yavaşça dağıtın. Düzgün bir tuz tabakası elde etmek için kaba dokunun. İpeği polimerize etmek için RT'de 48 saat inkübe edin.
- Polimerizasyonu sonlandırmak ve kalan sıvıyı buharlaştırmak için iskele içeren PTFE kalıbını 60 °C'de 1 saat fırına yerleştirin.
- PTFE kalıbının içindekileri, tuzu süzmek için 48 saat boyunca 2 L damıtılmış su içeren bir behere yerleştirin. Suyu günde 2-3 kez değiştirin. Tuz tamamen sızdığında sünger iskeleleri kalıplardan çıkarın.
Durma noktası: Süngerler, iskelelerin susuz kalmasını önlemek için kapalı bir kapta 4 °C'de suya batırılmış olarak saklanabilir.
- Hazır olduğunuzda iskeleleri 5 mm çapında bir biyopsi zımbası ile kesin. İskeleleri yaklaşık 2 mm yüksekliğe ulaşacak şekilde önceden kesin. 2 mm çapındaki biyopsi zımbası ile iskelenin merkezini delin (Şekil 2A). (1 saat)
- İskeleleri sterilize etmek için suya batırılmış otoklavlayın (ıslak döngü, 121 °C, 20 dakika).
Durma noktası: Süngerler, iskelelerin susuz kalmasını önlemek için kapalı bir kapta 4 °C'de suya batırılmış olarak saklanabilir.
- Planlanan hücre tohumlamasından önce, iskeleleri steril bir 0.1 mg / ml poli-D-lizin (PDL) çözeltisine daldırın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Bağlı olmayan PDL'yi çıkarmak için iskeleleri 3x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın. (30 dk)
2. Sıçan Kortikal Nöronlarının İzolasyonu
- Onaylanmış hayvan protokolü elde edildikten sonra embriyonik gün 18 (E18) Sprague-Dawley sıçanlarından korteksleri inceleyin. (2 saat)
- 10 korteksi 5 ml% 0.25 tripsin ve% 0.3 DNaz I (sığır pankreasından) içinde 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- 1 mg / ml soya fasulyesi proteini ekleyerek tripsini inaktive edin.
- Tek hücreli bir süspansiyon oluşana kadar 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 10 ml'lik bir Pasteur pipeti kullanarak korteksleri ezin. Nazik olun ve hava kabarcığı oluşumundan kaçının. (10 dk)
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 127 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini 10 ml kültür ortamında (Nörobazal ortam, 1x B27 takviyesi, 1x Glutamax, %1 penisilin / streptomisin) yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın. Beklenen hücre konsantrasyonu yaklaşık 2x107/ml'dir. (20 dk)
3. Derleme ve Kültür Oluşturun
- Hücrelerle iskele tohumlama
- Steril iskeleleri ve gerekli tüm kapları bir hücre kültürü davlumbazının içine taşıyın. İskeleleri, steril forseps kullanarak 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasına yerleştirin ve her kuyu için bir iskele ayırın. (10 dk)
- Hücre tohumlamadan önce dengelemek için iskeleleri hücre kültürü ortamına daldırın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin. (10 dk)
- Ortamın fazlalığını iskelelerden aspire edin.
- 100 μl hücre süspansiyonu/iskelesi uygulayın. (10 dk)
- Hücrenin iskeleye bağlanmasına izin vermek için hücreleri 37 °C O/N'de inkübe edin.
- Ertesi sabah, bağlanmamış hücreleri aspire edin ve 200 μl / kuyu taze kültür ortamı uygulayın. (10 dk)
- Kollajen matrisi ile iskele gömme. (2 saat)
- Buzun üzerine 10x PBS, su, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu I kollajeni yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre çalışan bir kolajen çözeltisi hazırlayın. Hücre tohumlu yapılar hazır olana kadar (1 saate kadar) buz üzerinde tutun.
- Hücre tohumlu ipek yapıları inkübatörden çıkarın ve fazla ortamı aspire edin.
- İskeleleri steril forseps kullanarak kuyu plakası üzerindeki boş kuyucuklara aktarın ve her iskeleyi 100 μl 3 mg/ml kollajen solüsyonuna daldırın. Kollajen polimerizasyonuna izin vermek için doku kültürü plakasını 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
- 100 μl önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı/kuyusu uygulayın. Yapıları bir hafta boyunca kültürleyin, her gün ortamın hacminin sadece yarısını değiştirerek ortamı değiştirin.
