$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Yeniden Kaplamadan Önce Farklılaşma Süresi
- Nöronlar süreçleriyle kalın bir ağ oluşturana ve sadece MAP2 veya TuJ1 gibi erken nöronal belirteçleri değil, aynı zamanda NeuN gibi geç belirteçleri de ifade edene kadar, tercih edilen bir protokol kullanarak 10 cm'lik tabaklardaki nöronları ayırt edin.
- Nöronal farklılaşma sürecinde her 4 günde bir tercih edilen ortamın yarısını değiştirin.
not: Daha yaygın veya sık ortam değişiklikleri, temel trofik faktörleriaq seyreltir ve olgunlaşmayı olumsuz etkileyebilir.
- iPSC'den türetilmiş WT126 nöronları için, aşağıdaki farklılaşma sonrası kültür ortamını kullanın: 5 mL 100x N2 (nöral) takviyesi, 10 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), 10 ng/mL glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF), 1 μg/mL laminin, 200 μM askorbik asit, 1 μM dibutiril-cAMP ve 500 mL Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın ortam/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) için 10 mL SM1. Yavaş yavaş, yarı ortam değişikliklerini kullanarak, nöral bazal ortam (Malzeme Tablosu) ve aynı takviyelerle değiştirin.
- İndüklenmiş pluripotent kök hücre veya iPSC'den türetilmiş CVB WT nöronları için, aşağıdaki farklılaşma sonrası kültür ortamını kullanın: 500 mL nöral bazal A ortamı (Malzeme Tablosu) ve 2 μg/mL laminin, 10 mL glutamin takviyesi ile 500 mL DMEM/F12 ortamı (Malzeme Tablosu), 0.75 mg / mL sodyum bikarbonat, 5 mL minimum esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asitler, 0.2 mM askorbik asit, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 ve 10 mL 100x N2 takviyesi.
2. Çoklu kuyuların kaplanması
- Yeniden kaplamadan bir gün önce poli-L-ornitin (PLO) ile kaplayın. Bir stok çözeltisi (10 mg / mL) yapmak için PLO'yu steril suda çözün. Bu stoğu -20 °C'de saklayın. Cam kaplarken 50 μg/mL ve plastik kaplarken 1:1.000 oran (10 μg/mL) konsantrasyon elde etmek için PLO'yu 1:100 oranında su ile seyreltin.
- Kaplamayı doğrudan hedef plakalara uygulayın. Plaka boyutuna uygun kaplama hacmini kullanın (yani, 24 oyuklu bir plaka için oyuk başına 500 μL PLO çözeltisi uygulayın).
- Plakaların gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta oturmasına izin verin.
- Kaplanmış plakaları yeniden kaplama gününde alın ve steril bir biyogüvenlik kabinine aktarın.
- FKÖ solüsyonunu aspire edin ve iki kez steril su ile durulayın.
- Laminini (1.15 mg / mL) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:400 seyreltmede seyreltin.
not: Laminini 4 °C'de çözün ve laminin ve düzensiz kaplamanın toplanmasını önlemek için hızla PBS'ye ekleyin.
- Steril suyu aspire edin ve daha önce FKÖ ile kaplanmış kuyucuklara 500 μL laminin kaplama uygulayın.
- Plakaları en az 4-6 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Cam yüzeyler için 16 saate kadar daha uzun inkübasyonlar kullanın. Tutarlı inkübasyon süreleri kullanın.
3. Farklılaşmış Nöronların Yeniden Kaplanması
- Farklılaşmış nöronların plakasını PBS ile bir kez nazikçe durulayın. PBS'yi bozmamak için doğrudan hücrelerin üzerine değil, plakanın duvarından aşağıya nazikçe dağıtın.
- PBS'yi nazikçe aspire edin, hücrelere doğrudan dokunmaktan kaçınmaya dikkat edin, ancak araştırmacıya doğru eğilirken yemeğin kenarından aspire etmeye dikkat edin.
- 10 cm'lik plaka başına en az 1 mL proteolitik enzim (Malzeme Tablosu) uygulayın ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Doku kültürü odası, düşük nem nedeniyle yüksek buharlaşma hızı sergiliyorsa, biraz daha yüksek hacimler ekleyin.
- Hücreleri proteolitik enzimle 40-45 dakika inkübe ederek plakadan ayırın ve nöronal ağ içindeki diğer nöronlardan ayırın.
not: Bu adımda zamanlama çok önemlidir. Proteazın çok erken söndürülmesi, yeniden kaplamadan sonra hücre ölümünün artmasına neden olabilir. Proteolitik enzim üreticisi, 37 ° C'den çok daha düşük sıcaklıkların, hücre hatlarını geçmek için daha uzun inkübasyon süreleri ile kullanılmasını önermektedir (örneğin, gece boyunca 4 ° C'de). Bununla birlikte, nöronların 4 ° C'de kullanılmasından kaçınılmalıdır, çünkü soğuğa maruz kaldıktan sonra genellikle zayıf sağkalım gösterirler. Üretici ayrıca, enzim ile 37 ° C'de 60 dakikalık bir inkübasyonun enzimatik inaktivasyonuna yol açtığını belirtmektedir. Bununla birlikte, yazarların deneyimlerine göre, hiPSC'den türetilmiş nöronal kültürlerin 37 ° C'de 40-45 dakikalık bir inkübasyonu, verimli ayrışma ve yeniden kaplama üzerine mükemmel nöronal sağkalım için yeterlidir.
- İnkübasyon süresi boyunca nöronları bir faz kontrast mikroskobunda kontrol edin ve nöral ağ plakadan tamamen ayrılana ve plakayı mikroskop altında kısaca salladıktan sonra daha küçük tabakalara ayrılmaya başlayana kadar proteaz tedavisinin devam etmesine izin verin.
- Sindirimi durdurmak için 10 cm'lik plakada 1 mL proteaz başına 5 mL taze DMEM ortamı kullanarak proteaz aktivitesini söndürün. Serolojik pipetler kullanarak ağı bozmak için hücreleri plakaya 5-8 kez nazikçe ezin. Farklılaşmış nöronlar kırılgan olduğundan, tritürasyon yaparken çok fazla baskı uygulamamaya dikkat edin. P1000 ucu kullanmayın, çünkü uç çok keskin ve dardır ve bu nedenle nöronları sarabilir veya zarar verebilir.
- Hücrelerle çözeltiyi, 100 μm çapında bir ağ örgüsüne sahip bir hücre süzgecinden 50 mL'lik taze bir konik tüpe damla damla uygulayın.
- Hücreler süzüldükten sonra süzgeci 5 mL ilave taze DMEM ortamı ile durulayın.
- Hücreleri tezgah üstü santrifüjde 1.000 x g'da 5 dakika döndürün.
- Konik tüpü biyogüvenlik kabinine geri koyun ve hücrelerin nemi tutmasını sağlamak için yaklaşık 250 μL bırakarak ortamın çoğunu aspire edin.
- Hücreleri 2 mL taze DMEM ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Peleti tüpün yan tarafına doğru pipetlemeyin. Bunun yerine, konik tüpü 2-3 kez nazikçe ters çevirin ve hücreleri çıkarmak için 5 mL'lik bir serolojik pipetin ucundan geçirin.
- Bir hemositometrenin kenarına 10 μL yeniden askıya alınmış nöron uygulayın.
- Bu yeniden süspansiyon adımı sırasında hücre canlılığını değerlendirmek için hücre damlacığına 8-10 μL tripan mavisi ekleyin. Bu karışımın 10 μL'sini hemositometreye veya diğer otomatik hücre sayaçlarına uygulayın. Faz parlak olan hücreleri canlı olarak değerlendirin ve tripan mavisi boyasını hariç tutun.
- Canlı hücrelerin / mL'nin miktarını belirleyin ve konik tüpün içeriğini istenen hücre yoğunluğuna göre seyreltmeye hazırlanın.
- 384 oyuklu bir plaka için oyuk başına ~ 10.000 hücre plakası; 24 oyuklu bir plaka için oyuk başına ~ 150.000-200.000 hücre plakası.
- Uygun seyreltme elde etmek için yeniden süspanse edilmiş hücrelerin konik tüpüne taze DMEM ekleyin ve spesifik hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak B27 ve / veya BDNF gibi ek uygun takviyeler ekleyin.
- 2-3 kez karıştırmak için konik boruyu hafifçe eğin.
- 16 kanallı bir pipet kullanarak 24 oyuklu plakadan veya 384 oyuklu çok kuyulu plakadan laminin kaplamayı aspire edin ve PBS ile bir kez durulayın.
- 24 oyuklu plaka için bir P1000 veya 384 oyuklu plakalar için 16 kanallı pipet kullanarak PBS'yi aspire edin.
- Topaklanmayı önlemek için hücre çözeltisini sekiz şeklinde bir hareketle her bir oyuğa uygulayın. Kaplama homojenliği, otomatik sıvı işleme cihazları kullanılarak da optimize edilebilir.
not: Kaplamadan 2-4 gün sonra başlayarak ortama laminin eklenmesi de hücrelerin homojen bir dağılımının korunmasına yardımcı olur.
- Her kuyucuk için 3.19 ve 3.20 adımlarını tekrarlayın.
- Plakayı 37 °C ve% 5 karbondioksit olarak ayarlanmış inkübatöre geri koyun.
- 2 gün sonra, bölüm 1.2'de açıklanan farklılaşma sonrası kültür ortamını kullanarak her 4 günde bir ortamın yarısını değiştirmeye başlayın.