$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Fotolitografi ile SU-8 kalıp imalatı
>NOT: Bu prosedür tehlikeli kimyasalları içerir. Baştan sona çeker ocak ve KKD kullanın.
- Silikon gofreti (4 inç çapında, 1 mm kalınlığında, cilalı) asetonla temizleyin ve nitrojen gazı ile üfleyin. Daha sonra kuruması için 180 °C'de 3 dakika pişirin.
- Temizlenmiş bir gofret üzerine 3 mL SU-8 2100 dağıtın.
- SU-8'i 10 saniye boyunca 500 rpm'de bir sıkma kaplayıcı kullanarak gofret üzerine düzgün bir şekilde kaplayın ve ardından 150 μm kalınlığında bir SU-8.
NOT: Silikon gofretin sıkma kaplayıcının ortasına yerleştirildiğinden ve vakumla doğru şekilde sabitlendiğinden emin olun.
- Gofretleri sıcak plaka üzerinde 50 °C'de 10 dakika, 65 °C'de 7 dakika ve 95 °C'de 45 dakika yumuşak şekilde pişirin.
- Fotoğraf maskesini (Şekil 1) maske hizalayıcıya ayarlayın ve 365 s.
NOT: Maruz kalma süresinin uygun bir UV ışığı dozu ile optimize edilmesi gerekir.
- Maruz kaldıktan sonra, gofreti 65 °C'de 6 dakika ve 95 °C'de 13 dakika sıcak plakada pişirin.
- Gofret'i SU-8 geliştiricisinde 10-20 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı kullanarak çalkalama ile geliştirin, işlem sırasında gelişen çözeltiyi bir kez değiştirin.
NOT: SU-8'in kalıntıları kaldığında geliştirme süresini uzatın.
- Gofret'i izopropanol içinde durulayın ve gofret'i nitrojen gazı ile nazikçe kurulayın.
- Biriken SU-8'in yüksekliğini bir ölçüm mikroskobu ile ölçün ve yaklaşık 150 μm kalınlığında olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan bazlı doku kültürü çip üretimi
- SU-8 ile biriktirilmiş gofreti çift taraflı bantla bir kaba (örn. 15 cm plastik Petri kabı) sabitleyin.
- Nitrojen gazı kullanarak gofretin üzerindeki tozu üfleyin.
- Sililanize etmek için, SU-8 ile biriktirilmiş gofretleri küçük bir kapla (örneğin, 35 mm'lik tabak) birlikte bir vakum odasına koyun. Küçük kabın içine 10 μL (tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)-1-triklorosilan bırakın. (tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)-1-triklorosilan'ı SU-8 gofrete doğrudan uygulamayın.
- Vakum odasını sıkıca kapatın ve en az 2 saat boyunca bir vakum pompasını açın.
- Plastik bir kap alın ve silikon elastomeri (örneğin, Silpot 184 veya eşdeğeri, Sylgard 184) ve sertleştirici maddeyi 10:1 ağırlık oranında dökün. Ardından, bir spatula kullanarak iyice karıştırın ve kabarcıklar tamamen çıkana kadar vakum odasında gazı alın.
- PDMS karışımını SU-8 gofret ile istenen kalınlığa (3-4 mm) kadar kabın içine dökün ve kabarcıkları çıkarmak için tekrar gazını alın.
- PDMS'yi tamamen kürlemek için PDMS'yi 60 °C'de bir fırında en az 3 saat pişirin.
- Soğuduktan sonra, kürlenmiş PDMS'yi bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak gofretten kesin.
- Doku kültürü çipinin iki odacığını oluşturmak için, 1,5 mm çapında bir biyopsi zımbası kullanarak iki bölmenin bulunduğu yere iki delik açın.
- Orta boy bir rezervuar oluşturmak için başka bir PDMS karışımı (silikon elastomer ve 10:1 ağırlık oranında sertleştirici) hazırlayın ve 10 cm'lik yeni bir Petri kabına dökün. Dökme hacmini 5 mm PDMS kalınlığına ayarlayın.
- PDMS'yi tamamen kürlemek için PDMS'yi 60 °C'de bir fırında en az 3 saat pişirin.
- PDMS'yi soğuttuktan sonra, dikdörtgen bir halka elde etmek için kürlenmiş PDMS'yi bir neşter ile kesin.
- Aralarına kürlenmemiş PDMS uygulayarak ve monte edilmiş PDMS katmanlarını pişirerek alt katmanı orta rezervuar ile birleştirin. Bu bağlı yapı, PDMS doku kültürü çipi ile sonuçlanır.
- Yüzeydeki tozu ve küçük parçacıkları temizlemek için PDMS doku kültürü çipini bantla temizleyin. PDMS doku kültürü çipleri, toz ve UV'den korunduğu takdirde oda sıcaklığında saklanabilir.
3. Kültürün hazırlanması
- Kültür ortamı
not: Aşağıda listelenen tüm ortamlar, aksi belirtilmedikçe sterilizasyon için filtrelenmelidir. Hazırlanan besiyerleri 4 °C'de saklanabilir ve bir ay içinde kullanılabilir.
- mTeSR Plus besiyerini hazırlamak için: bir şişe 100 mL mTeSR Plus 5x takviyesini bir şişe 400 mL mTeSR Plus Bazal Orta ile birleştirin.
- 100 mL KSR ortamı hazırlamak için: 85 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium veya DMEM / F12'sinde, 15 mL Nakavt serum replasmanı (KSR,% 15), 1 mL ticari glutamin takviyesi (% 1) ve 1 mL esansiyel olmayan amino asit (NEAA,% 1) ekleyin.
- 100 mL N2 ortamı hazırlamak için: 100 mL Nörobazal ortamda, 1 mL N2 (100x), 1 mL ticari glutamin takviyesi ve 1 mL NEAA ekleyin.
- 250 mL Olgunlaşma ortamı hazırlamak için: 250 mL Nörobazal ortama 5 mL B27 (% 2), 2.5 mL ticari glutamin takviyesi (% 1) ve 2.5 mL Penisilin / Streptomisin (% 1) ekleyin.
- Hücre kültürü dereceli DMSO'daki bileşikleri (retinoik asit (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) istenen konsantrasyona yeniden süspanse edin. Alikotları hazırlayın ve -20 °C'de 6 aya kadar saklayın. Aşağıdaki stok çözeltileri kullanılır: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Kaplama
not: Bazal membran matrisinin ısı ile polimerizasyonunu önlemek için, tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kaçının. Tüm kaplama prosedürlerini mümkünse önceden soğutulmuş pipet uçları ve tüplerle gerçekleştirin. Bazal membran matrisi gece boyunca 4 °C'de çözülmeli ve önceden soğutulmuş pipet uçları ve tüpleri kullanılarak ayrılmalıdır. Alikotlar -20 °C veya -80 °C'de dondurulabilir.
- Dondurulmuş alikotu buz üzerinde 4°C'de çözün. Kaplama işlemi sırasında alikot soğuk tutulmalıdır. Önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak, bazal membran matrisini buz gibi DMEM/F12 ile 1:40 oranında seyreltin. Kullanılmayan seyreltilmiş bazal membran matrisi, polimerizasyon meydana gelmediği göz önüne alındığında, 4 °C'de 2-3 gün saklanabilir.
- 6 oyuklu plakanın bir kuyusunu kaplamak için 1 mL bazal membran matrisi/DMEM-F12 çözeltisi ekleyin.
- Plakayı oda sıcaklığında en az bir saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kaplamalı plakalar 4 °C'de en fazla bir hafta saklanabilir.
>4. iPS hücrelerinin bakımı
- Daha önce adım 3.2'de belirtildiği gibi bazal membran matris kaplı tabaklar hazırlayın.
- mTeSR Plus ortamını tamamen aspire edin. Kuyuyu bir kez PBS ile yıkayın ve 0.5 mL pasaj reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Birkaç saniye bekleyin ve çözeltiyi aspire edin.
- Plakayı 37 ° C'de inkübatörde 5 dakika veya hücreler yuvarlak hale gelene kadar inkübe edin.
not: Kuluçka süresi, farklı iPS hücre hatları ve birleşme arasında değişebilir. İnkübasyon sırasında ayrışma süresini belirlemek için lütfen mikroskop altında periyodik olarak kontrol edin.
- 1 mL mTeSR Plus medium ekleyin ve kolonileri ayırmak için plakaya 30-60 saniye vurun.
- 1 mL hücre süspansiyon solüsyonunu 7 mL taze mTeSR artı orta ile nazikçe karıştırın. 5 defadan fazla pipetlemeyin.
- 1:8 oranında plaka. Tipik olarak adım 5.5'ten 1 mL süspansiyon ekleyin ve 1 mL mTeSR artı 5-10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş ortam ekleyin. Geçiş seyreltme oranı iPSC hattına bağlıdır.
- Hücreyi %5 CO2/37 °C inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, taze mTeSR Plus medium ekleyerek Y-27632'yi çıkarın. Bundan sonra, başlangıçta her gün ve hücre daha yüksek birleşme noktasına ulaştığında her gün ortamı değiştirin.
5. iPS hücrelerinin motor nöronlara farklılaşması
- Motor nöron farklılaşması için iPSC'yi geçirme
not: Farklılaşma, 3D (5.2) protokolünde başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir.
- Farklılaşmamış iPS hücrelerinin, 6 oyuklu bir plakada mTeSR Plus ortamında yaklaşık% 80'lik bir birleşmeye ulaşana kadar büyümesine izin verin.
- Ortamı tamamen aspire edin. İyiliği hemen bir kez steril PBS ile yıkayın ve hücrelere 0.5 mL hücre ayrışma çözeltisi ekleyin.
- Plakayı inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık 2-3 dakika veya hücreler ayrılıp yuvarlak hale gelene kadar ancak kuyuya bağlı kalana kadar inkübe edin.
- 1 mL orta ekleyin ve 5 mL serolojik pipet kullanarak birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 4 mL ortamdan oluşan 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice aspire edin, peleti rahatsız etmeyin ve hücreleri 10 μM Y-27632 ile takviye edilmiş ortamın 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 5.2'ye (3D farklılaşma) devam edin.
- 3D farklılaşmada motor nöron sferoidinin (MNS) oluşumu ("3D protokolü")
not: Farklılaşmanın 0-12. günlerinden itibaren günlük olarak tam bir orta değişim yapılır (Şekil 2).
- iPS hücrelerini, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 100 μL mTeSR Plus içinde 40.000 hücre / kuyuda 5.1.7 adımından 96 oyuklu U alt plakaya tohumlayın.
- Ertesi gün, her bir kuyucuğu 100 μL taze ortamla değiştirin.
- 0. ve 1. günlerde: Kültür ortamını aspire edin ve 10 μM SB431542 ve 100 nM LDN-193189 ile desteklenmiş 100 μL KSR ortamı (3.1.2) ile değiştirin.
- 2. ve 3. günlerde: Kültür ortamını aspire edin ve 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA ve 1 μM SAG ile desteklenmiş 100 μL KSR ortamı ile değiştirin.
- 4. ve 5. günlerde: %75 KSR ortamı ve %25 N2 ortamından (3.1.3) oluşan karışık bir ortam hazırlayın. Daha sonra, kültür ortamını aspire edin ve 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA ve 1 μM SAG ile desteklenmiş 100 μL karışık ortam ile değiştirin.
- 6. ve 7. günlerde: %50 KSR ortamı ve %50 N2 ortamından oluşan karışık bir ortam hazırlayın. Daha sonra, kültür ortamını aspire edin ve 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinoik asit ve 1 μM SAG ile takviye edilmiş 100 μL karışık ortam ile değiştirin.
- 8. ve 9. günlerde: %25 KSR ortamı ve %75 N2 ortamından oluşan karışık bir ortam hazırlayın. Daha sonra, kültür ortamını aspire edin ve 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA ve 1 μM SAG ile desteklenmiş 100 μL karışık ortam ile değiştirin.
- 10. ve 11. günlerde: Ortamı 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA ve 1 μM SAG ile desteklenmiş 100 μl N2 ortamı ile değiştirin.
- 12. günde: MN'leri doku kültürü çipine aktarmaya devam edin (Adım 6) veya ortamı 20 ng / mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile desteklenmiş 100 μL Olgunlaşma ortamı (3.1.4) ile değiştirin.
not: MNS, 12. günden 19. güne kadar doku kültürü çipine aktarılabilir. Transfer edilmeyen sferoidler, transfer edilene kadar 20 ng/mL BDNF ile desteklenmiş Olgunlaşma ortamında 96 kuyulu U alt plakada kültürlenmiş halde tutulmalıdır.
6. Motor sinir organoid (MNO) oluşumu için doku kültürü çipinin hazırlanması
- Hazırlanan PDMS'yi (adım 2.13'ten itibaren) Petri kabında en az 1 saat boyunca %70 etanole batırarak sterilize edin<>
not: Aşağıdaki tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde manipüle edilmelidir.
- Mikroskop camını (76 x 52 mm) Petri kabına %70 etanole batırarak sterilize edin.
- Mikroskop camının kurutma işlemi sırasında PDMS cihazını yarı ıslak mikroskop camının üzerine yerleştirin ve bir gece bekleterek tamamen kurumasını bekleyin. Tamamen kuruduktan sonra, PDMS cihazı cama yapışmalıdır.
not: Bu bağlanma, doku toplama için kültürden sonra PDMS cihazlarının mikroskop camından ayrılmasına izin vermek için kalıcı değildir. Oksijen plazması ile kalıcı bağlama, PDMS ve cam arasındaki yapışmayı en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilir, ancak talaşların sökülmesini ve doku toplanmasını yasaklar.
- Kanalın girişinin bir tarafında bir damlacık yaparak PDMS cihazında ve mikroskop camında mikrokanalın yüzeyini DMEM/F12'de (1:40) 30 μL seyreltilmiş bazal membran matrisi ile kaplayın ve ardından çözeltiyi girişin diğer tarafından bir pipet veya emme pompası ile aspire edin (Şekil 3A). Kabarcık kontaminasyonunu önlemek için çok fazla miktarda çözelti aspire etmeyin.
- Ardından, PDMS cihazını oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de ikincil bir kapta (örn. Petri kabı) inkübe edin.
7. Motor sinir organoid (MNO) oluşumu
- Kaplama solüsyonunu, kullanmadan hemen önce 20 ng / mL BDNF ile desteklenmiş önceden ısıtılmış 150 μL Olgunlaşma ortamı ile değiştirin.
- Ardından, adım 5.2.9'daki MNS'yi geniş delikli uçlu bir mikropipet kullanarak mikro kanalın girişine yerleştirin. MNS, yerçekimi ile cihazın altına kendiliğinden yerleşebilir. MNS'yi enjekte ederken çok fazla basınç uygulamayın (Şekil 3B).
not: MNS, bir doku kültürü çipindeki bir deliğin yan duvarına sıkışmışsa, çözeltiyi girişin başka bir tarafından nazikçe aspire edin.
- Küçük bir rezervuarı (örneğin, 15 mL'lik bir tüp kapağı) steril suyla doldurun ve orta buharlaşmayı önlemek için ikincil kapta doku kültürü çipinin yanına yerleştirin. Ardından, %5 CO2/37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Orta bir değişiklik için, tükenmiş kültür ortamını orta rezervuarın merkezinden aspire edin (Şekil 3C). Tüm ortamı ve dokuyu aspire etmeyin.
- Yavaşça taze Olgunlaşma ortamı ekleyin (BDNF ile). Ortam her 2-3 günde bir değiştirilmelidir. Kültür ortamını kültür sırasında hiçbir zaman kurutmayın. Aksonlar bir MNS'den kanala doğru büyür ve 2-3 hafta içinde kendiliğinden tek bir demet halinde toplanır, bu da bir MNO oluşumuna neden olur. MNO, cihazda 1 aydan daha uzun süre kültürlenebilir.
