$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücre Kültürleri ve Ön Farklılaşma
- Nöral kök hücre kültürü ve ön farklılaşma
- Poli-D-lizin kaplı lameller hazırlayın. 12 oyuklu bir plakaya steril bir lamel (20 mm çapında) koyun. Aşağıdaki adımları izleyerek lameller üzerinde daha iyi hücre yapışması için kapak camını% 0.1 w / v olan poli-D-lizin ile kaplayın.
NOT: Her hücre hattı ve uygulama için en uygun koşullar belirlenmelidir.
- Lamelin yüzeyini aseptik olarak su içinde% 0.1 w / v olan poli-D-lizin ile kaplayın. Lamel yüzeyinin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.
- 37 ° C'de gece boyunca (~ 12 saat) kültürlendikten sonra, poli-D-lizin çözeltisini çıkarın ve yüzeyi 3x 1 mL steril su ile durulayın.
- Hücreleri tohumlamadan önce en az 30 dakika kurulayın.
- Murin nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSC) kültürü ve prediferansiyasyonu
- C17.2-NSC'leri 25 cm'lik 2'lik bir şişede inkübe edin Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinde (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 5 at serumu (HS) ve% 1 penisilin / streptomisin 37 ° C'de ve% 5 CO2 ~ 2 - 3d için.
- Hücreler% 85 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın, hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve şişeye 1 mL taze tripsin (% 0.25) ekleyin. 1 dakika bekletin; daha sonra, şişeye 1 mL kültür ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Bir hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu sayın. 2 x 104 hücre / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonu vermek için gerekli hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın.
- C17.2-NSC'leri, oyuk başına ~ 2 x 104 hücre yoğunluğuna sahip 12 oyuklu plakadaki kaplanmış lameller üzerine tohumlayın. Hücre yoğunluğunu mikroskop altında kontrol edin.
NOT: Daha iyi bir sonuç için, immünofloresan deneyinden önce optimal hücre yoğunluğu belirlenmelidir.
- Hücreleri 37 ° C'de bir hücre inkübatöründe 12 saat boyunca inkübe edin.
- Bağlandıktan sonra, hücreleri 2x 1 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri, plazma işleminden önce 48 saat boyunca% 1 N2 takviyesi ile DMEM / F12'den oluşan bir farklılaşma ortamı ile yetiştirin.
- Primer sıçan nöral kök hücre kültürü ve prediferansiyasyonu
- Kaplanmamış T25 şişelerinde 5 x 105 hücre yoğunluğunda sıçan NSC büyüme ortamında birincil sıçan NSC (nöral kök hücreler) süspansiyonunu kültürleyin.
- Ters çevrilmiş bir mikroskop altında nörokürelerin oluşumunu kontrol edin. Nörosferlerin morfolojisinin küresel ve şeffaf çok hücreli kompleksler sergilediğinden emin olun.
- Nörosferler 3 mm veya daha büyük bir çapa ulaştığında, nörosfer süspansiyonunu 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve nörosferlerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
- Nörosferleri minimum hacimde ortamda bırakmak için süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Nörosferleri 1x 5 mL PBS ile durulayın ve nörosferlerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Minimum hacimde PBS bırakmak için süpernatanı çıkarın.
- Hücre yoğunluğunu mililitre başına ~ 12 - 15 nöroküreye ayarlamak için uygun bir hacimde farklılaşma ortamı ekleyin. Primer sıçan NSC'leri için farklılaşma ortamı DMEM/F12, %2 B27 ve %1 FBS'den oluşur.
- 12 oyuklu plakadaki her kaplanmış lamel üzerine 1 mL nörosfer süspansiyonu tohumlayın.
NOT: Nörosferlerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı hafifçe sallayın. Bu adım, daha iyi bir immünofloresan sonucu için kritik öneme sahiptir.
- Plakayı inkübatöre yerleştirin ve plazma işleminden önce 24 saat boyunca ön farklılaşmasına izin verin.
2. Plazma Jetlerinin Hazırlanması
- İç çapı 2 mm ve dış çapı 4 mm olan yarı açık bir kuvars tüp seçin. Tüpe 2 mm çapında yüksek voltajlı bir kablo yerleştirin.
- Kuvars tüpünü yüksek voltajlı telle birlikte 5 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin ve şırınganın ortasına monte etmek için bir tutucu kullanın. Kuvars tüpün kapalı ucu ile şırınga ucu arasındaki mesafeyi 1 cm olarak ayarlayın.
- Şırınganın açık ucuna 1 m'lik bir silikon kauçuk boru (iç çapı 12 mm) bağlayın ve ardından sırayla debimetreye ve gaz vanasına bağlayın.
3. Jetlerin Satın Alınması
- Devreyi Şekil 1'de gösterildiği gibi bağlayın. Güç kaynağının çıkış kablosunu plazma jet cihazına bağlayın ve ardından voltajı algılamak için yüksek voltaj probunun ucunu çıkış kablosuyla bağlayın. Çıkış voltajının bilgilerini kaydetmek için yüksek voltaj probunun diğer ucunu osiloskopa bağlayın. Tüm devreyi kontrol edin ve güç kaynağının, osiloskopun ve yüksek voltaj probunun hepsinin topraklandığından emin olun.
- Gaz hattını kontrol edin. Gaz tüpünün plazma jet cihazına bağlı olduğundan emin olun; daha sonra helyumun (hacim fraksiyonu, %99,999) ve oksijenin (hacim fraksiyonu, %99,999) gaz vanasını açın ve gaz akışını 1 L : 0,01 L/dk (He:O2).
NOT: Güç kaynağını ilk kez açmadan önce gazın birkaç dakika akmasına izin verin.
- Darbe genliğini, frekansını ve darbe genişliğini sırasıyla 8 kV, 8 kHz ve 1600 ns olarak ayarlayın. Devreyi tekrar kontrol edin ve ardından bir plazma jeti oluşturmak için çıkış düğmesini açın.
DİKKAT: Yüksek voltajlı kabloya hiçbir zaman dokunmayın.
4. Nöral Kök Hücrenin Plazma Tedavisi
- Şırınganın nozulu ile hücre kuyusu deliği arasındaki mesafeyi 15 mm'ye ayarlayın.
NOT: Mesafe, 12 oyuklu plakanın yerleştirildiği platformun altından ölçülür.
- 12 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve önceden farklılaşmış hücrelerin ortamını 800 μL taze farklılaşma ortamına değiştirin.
- Hücreleri üç gruba ayırın: tedavi edilmemiş bir kontrol grubu, 60 s He-ve-O2 (% 1) gaz akışı tedavi grubu ve 60 s plazma tedavi grubu.
NOT: Tedavi koşulunda belirgin bir sıvı kaybı yoktur.
- 12 oyuklu plakayı plazma jetlerinin altına yerleştirin, şırınga memesinin her deliğin ortasına sabitlendiğinden emin olun ve adım 4.3.
'da belirtilen farklı gruplara ilgili tedaviyi uygulayın
NOT: İşlem görmemiş kontroller, tek tip tedavi koşullarını sağlamak için deneysel prosedür sırasında oda sıcaklığında farklılaştırma ortamında tutulmuştur. He-ve-O2 (% 1) gaz akışı tedavi grubu, plazma oluşumu olmadan sadece He ve O2 (% 1) gaz akışı ile muamele edildi. Tüm tedaviler üç nüsha halinde yapılmalıdır.
5. Nöral Kök Hücre Farklılaşması
- İşlemden sonra, orijinal kültürü çıkarın ve her oyuğa 1 mL yeni farklılaşma ortamı ekleyin.
- Hücreleri inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 6 gün boyunca inkübe edin. Ortamı her gün değiştirin.
- Ters faz kontrastlı ışık mikroskobu altında farklı grupların farklılaşma durumunu günlük olarak kontrol edin Şekil 2. Rastgele en az 12 alan seçin ve morfolojik değişiklikleri kaydetmek için fotoğraf çekin.
