Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Kortikal İnternöron Öncüllerinin Üretilmesi

Özet

Kaynak: Tischfield, D. J., et al Fare Embriyonik Kök Hücrelerinin Kortikal İnternöron Öncülerine Farklılaşması. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron öncüleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Protokol, kök hücrelerin, kök hücre çoğalmasını ve embriyoid cisimlere (EB'ler) agregasyonunu kolaylaştıran spesifik küçük molekül inhibitörleri içeren ortamlarda kültürlenmesini gerektirir. Daha sonra, EB'ler enzimlerle ayrıştırılır ve kortikal internöron öncülerine farklılaşmalarını teşvik etmek için adezyon proteinleri ile kaplanmış kültür plakası kuyucukları üzerine kaplanır.

Protokol

1. Medya Hazırlama

NOT: Tüm ortamları 37 °'ya ısıtın; Hücre kültüründe kullanmadan önce C.

1. Fare Embriyonik Fibroblast (MEF) ortamı (500 mL hazırlamak için)
   1. 449 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'una (DMEM) 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin ve 500 mL 0.22 μm gözenekli filtre ünitesinden süzün.
   2. Filtrasyondan sonra 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg / mL) ekleyin. Ortamı 4 °C'de 1 aya kadar veya ≤ -20 °C'de saklayın.
2. N2 ortamı (500 mL hazırlamak için)
   1. 489.5 mL DMEM: Besin Karışımı F-12'ye (DMEM / F-12) 5 mL L-alanin-L-glutamin (100x) ve 500 μL 2-Merkaptoetanol (55 mM) ekleyin ve 500 mL 0.22 μm gözenekli filtre ünitesinden süzün.
   2. Filtrasyondan sonra 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg / mL) ve 5 mL N2 takviyesi-B ekleyin. Ortamı 4 °C'de karanlıkta 1 aya kadar saklayın.
3. Serumsuz büyüme ortamı (KSR) (500 mL hazırlamak için)
   1. 75 mL serumsuz orta takviyesi, 5 mL L-glutamin (100x), 5 mL MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA) (100x) ve 500 μL 2-Merkaptoetanol (55 mM) 413.5 mL glutamin içermeyen DMEM içeren DMEM'e ekleyin ve 500 mL 0.22 μm gözenekli filtre ünitesinden süzün.
   2. Filtrasyondan sonra 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg / mL) ekleyin. Ortamı 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
4. Fare embriyonik kök hücre ortamı (500 mL hazırlamak için)
   1. 75 mL kök hücre sınıfı FBS, 5 mL MEM-NEAA (100x), 5 mL L-glutamin (100x) ve 500 μL 2-Merkaptoetanol (55 mM) içeren 413.5 mL glutamin içermeyen DMEM'e ekleyin ve 500 mL 0.22 μm gözenekli filtre ünitesinden süzün.
   2. Filtrasyondan sonra 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg / mL) ekleyin. Ortamı karanlıkta 4 °C'de 1 aya kadar veya alikotta saklayın ve ≤ -20 °C'de saklayın.

2. mESC'leri kültürleme

1. MEF ortamındaki mitotik olarak aktif olmayan MEF besleyici hücreleri, 3-4 x 10⁴ hücre/^cm2'de doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar üzerine plakalayın. mESC'leri kaplamadan önce ≥ %95 bağıl nem ve %5_CO2 ile 37 °C'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleşmeleri için en az 12 saat bekleyin. Hemen kullanılmayacaksa, MEF ortamını her 3 günde bir değiştirin. Kaplamadan sonraki 7 gün içinde kullanılmazsa MEF'leri atın.
2. Fare Lösemi İnhibitör Faktörü (mLIF) (1.000 U/mL) içeren mESC ortamındaki MEF plakalarına mESC'leri (yoğunluk aralığı 1-4 x^{10 4} hücre/^cm2 aralığı) ekleyin. Hücreleri 37 °C'de ≥ %95 bağıl nem ve %5 CO₂ ile inkübe edin.
3. Tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) (1: 5-1: 10) kullanarak, çanak ~% 70-80 birleştiğinde veya koloniler temas etmeye başladığında geçiş mESC'leri. Bu genellikle her 2 günde bir gerçekleşir, ancak ilk kaplama yoğunluğuna bağlı olarak 4 veya 5 güne kadar sürebilir.
4. Pluripotentliği korumak için mESC'leri bir mESC ortamında bir MEF besleyici katmanında tutun.
5. Farklılaşmaya başlamadan önce, MEF'leri seyreltmek için hücreleri en az bir kez MEF'ler olmadan jelatin kaplı plakalara geçirin.​
   1. Doku kültürü ile muamele edilmiş bir kaba Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 jelatin ekleyerek ve en az 1 saat 37 ° C'de bırakarak jelatin kaplı plakaları hazırlayın. Plaka 1.5-2 x 10⁶ hücre / 10 cm plaka (2.7-3.6 x 10⁴ hücre /^cm2) ve farklılaşmaya başlamadan önce hücrelerin 2 gün genişlemesine izin verin.

3. mESC'leri MGE Benzeri Telenefalik Progenitörlere Göre Ayırt Etme

1. Farklılaşma günü (DD) 0 = "yüzen hücreler"
   1. mESC'ler 2 gün boyunca jelatin kaplı plakalar üzerinde büyüdükten sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri Ca^{2 +} / Mg^{2 +} olmadan PBS ile bir kez yıkayın. Plakanın yüzeyini kaplayacak kadar tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) ekleyin (tipik olarak 10 cm'lik bir doku kültürü kabı için 4 mL tripsin-EDTA) ve hücreleri 37 ° C'de %≥95 bağıl nem ve %5 CO₂ ile 4 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
   2. 4 dakika sonra, mESC ortamı ile hacmin 2 katı kullanarak tripsin-EDTA'yı söndürün. Hücreleri uygun büyüklükte bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. 5 dakika sonra tüpü çıkarın ve peleti bozmadan ortamı aspire edin. Pelet, BMP inhibitörü LDN-193189 (250 nM) ve Wnt inhibitörü XAV-939 (10 μM) içeren 1 mL KSR: N2 ortamında (1: 1) yeniden süspanse edin.
   3. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçün. Yapışık olmayan doku kültürü kaplarında LDN-193189 (250 nM) ve XAV-939 (10 μM) içeren KSR:N2 ortamına (1:1) 75.000 hücre / mL ekleyerek hücreleri embriyoid cisimcikleri (EB'ler) olarak büyütmeye başlayın. Hücreleri 37 °C'de ≥ %95 bağıl nem ve %5 CO₂ ile inkübe edin.
2. DD1'de, doku kültürü ile muamele edilmiş tabakları gece boyunca 37 °C'de %95'lik ≥ bağıl nemle veya en az 1 saat boyunca poli-L-lizin (Ca²⁺/Mg²⁺ ile PBS'de 10 μg/mL) ile kaplayarak hücre "inişine" hazırlanın.
3. DD2'de, poli-L-lizini aspire edin ve plakaları laminin ile kaplayın (Ca^{2 + /} Mg^{2 +} ile PBS'de 10 μg / mL) O/N'de 37 ° C'de ≥ %95 bağıl nem.
   not: O/N optimal olsa da, 2 saat kadar kısa bir süre yeterli olabilir. Plakalar ertesi güne kadar kullanılmazsa, laminini aspire edin, Ca^{2 +} / Mg^{2 +} içermeyen PBS ile değiştirin ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
4. DD3 ("kara hücreleri")
   1. EB ayrışmasına başlamadan önce, laminini aspire edin ve plakaların bir doku kültürü başlığında tamamen kurumasını bekleyin. Parlak veya gözle görülür şekilde ıslak görünen plakaları kullanmayın. EB'leri ortamla birlikte 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 15 x g'da 3-4 dakika veya EB'ler peletlenene kadar santrifüjleyin.
5. Ortamı aspire edin ve DNaz (2 U / mL) içeren 3 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve ≥% 95 bağıl nem ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. EB ayrışmasına yardımcı olmak için tüpü her 3 dakikada bir hafifçe vurun.
6. EB'ler artık görünür olmadığında veya 15 dakika geçtiğinde, DNaz (1 U / mL) içeren 6 mL KSR: N2 (1: 1) ekleyin ve 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
7. LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) ve ROCK inhibitörü Y-27632 (10 μM) içeren KSR: N2 (1: 1) içindeki hücreleri 4.5-5 x 10⁴ hücre /^cm2'de plakalayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fare embriyonik fibroblastları (CF-1, MEF, IRR 7M)	MTI-Küresel Kök	GSC-6101G	Dört adet 10 cm'lik TC plakası için 1 şişe 7M MEF yeterlidir.
FBS (FBS)	Atlanta Biyoloji	S11150H
Çuha çiçeği	Canlılık	Karınca-pm-2	Antimikrobiyal ajan olarak da bilinir. Temel ortamla filtrelemeyin - filtrelemeden sonra ekleyin.
N2 takviyesi-B	Kök Hücre Teknolojileri	7156	Temel ortamla filtrelemeyin -- filtrelemeden sonra ekleyin
Glutamax (100x)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	35050061	L-alanin-L-glutamin olarak da bilinir.
KnockOut Serum Değişimi (KSR)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	10828028	Serumsuz medyum takviyesi olarak da bilinir.
L-glutamin (100x)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	25030081
MEM-NEAA (100 kat)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11140050
2-Merkaptoetanol	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	21985023
Nakavt DMEM	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	10829018
Hyclone FBS	VWR (VWR)	82013-578	Kök hücre sınıfı FBS olarak da bilinir.
Doku kültürü uygulanmış tabak (10cm)	BD Şahin	353003
Yapışmayan steril petri kabı (10cm)	VWR (VWR)	25384-342
Lösemi inhibitör faktör (mLIF)	Kimya	ESG1107	Dondurmayın, 4°C'de saklayın.
DMEM/F12	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	11330032
% 0.1 Jelatin Çözeltisi	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC PCS-999-027
Laminin	Sigma	L2020
Poli-L-lizin	Sigma	P6282 Serisi
Tripsin-EDTA (% 0.05)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	25300054
Aktataz	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A1110501	Tripsin içermeyen hücre ayrışma reaktifi olarak da bilinir.
RQ1 RNaz İçermeyen DNaz	Promega	M610A Serisi
LDN-193189	Kök	04-1974	DMSO'da tekrar süspanse edin ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın
XAV939	Kök	04-1946	DMSO'da tekrar süspanse edin ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın
KAYA inhibitörü (Y-27632)	Tocris (Türkçe)	1254	DMSO'da tekrar süspanse edin ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın