Asılı Damla Yöntemi ile Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

Özet

Kaynak: Hanafiah, A., et al. Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Farklılaşması ve Karakterizasyonu. J. Vis. Exp. (2020).

Video, fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimlere (EB'ler) farklılaşmasını göstermektedir. mESC'leri asılı damlalarda askıya aldıktan ve inkübe ettikten sonra, hücreler, retinoik asit (RA) ile desteklenmiş bir farklılaşma ortamı kullanılarak nöronal progenitör hücrelere (NPC'ler) daha da farklılaşan EB'leri oluşturmak üzere toplanır.

Protokol

1. mESC kültürü

1. 10 cm'lik doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakayı %0.1 jelatin ile kaplayın ve jelatini aspire etmeden önce en az 15-30 dakika sertleşmesine izin verin.
2. mESC'leri önceden ısıtılmış mESC ortamında (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM)% 15 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler, β-merkaptoetanol, L-glutamin, penisilin / streptomisin, sodyum piruvat, Lösemi inhibitör faktör (LIF), PD0325901 (PD) ve CHIR99021 (CH)) ile kültürlenmeden bir gün önce tohum γ ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler).
3. E14 hücrelerini kültürlemeden önce γ ışınlanmış MEF'lerin yerleşmesine ve plaka yüzeyine yapışmasına izin verin.
4. E14 ESC'leri 37 °C su banyosunda çözdürün ve hücreleri ılık mESC ortamı ile 15 cm'lik konik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g'da pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın.
5. Hücreleri 10 mL mESC ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri, daha önce tohumlanan γ ışınlanmış MEF'leri içeren kültür plakası üzerine yerleştirin. Hücre kültürünü 37 ° C'lik bir inkübatörde% 5 CO₂ altında inkübe edin.
6. Kültür geçişi için ortamı aspire edin ve plakayı steril 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Plaka yüzeyini kaplayacak kadar% 0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
7. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için tripsini mESC ortamı ve pipet ile nötralize edin. Hücreleri 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
8. Hücreleri bir hemositometre veya hücre sayacı ile sayın ve 10 cm'lik bir kültür plakasında yaklaşık 5.0 x^{10 5} hücre tohumlayın.
9. Hücreleri 10 mL mESC ortamında yeniden süspanse edin, hücreleri jelatin kaplı doku kültürü plakası üzerine yerleştirin ve kültürleri daha önce tarif edildiği gibi inkübe edin.
   not: Hücrelerin kolonilerinde farklılaşmasını önlemek için mESC'lerin 2 günde bir geçirilmesi önerilir. Ortamdaki fenol kırmızısı yalnızca bir pH indikatörü olarak işlev görür ve hücresel yoğunluğa bağlı olarak 2 günden daha kısa sürede sarımsı (daha asidik) hale gelebilir. Bu nedenle, ortamı her gün değiştirmek gerekebilir. γ ışınlanmış MEF'ler, birkaç geçişten sonra sonunda ölecektir.

>2. EB, NPC ve nöron farklılaşması

1. Kültür geçiş protokolünü uygulayın ve hücreleri sayın.
2. Asılı damla yöntemi (gün 0)
   1. 10 cm'lik bir hücre kültürü plakası için, 5.0 x 10² hücrenin 20 μL farklılaşma ortamında (% 15 FBS ile DMEM, esansiyel olmayan amino asitler, β-merkaptoetanol, L-glutamin, penisilin / streptomisin ve sodyum piruvat) süspanse edileceği kabaca 2.5 x 10⁴ hücre sayın. Hücreleri içeren yaklaşık elli 20 μL damlacık, 10 cm'lik bir plaka üzerine kaplanabilir.
   2. Uygun sayıda hücreyi ayırın ve ardından hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   3. 20 μL'de 5.0 x 10² hücrelik bir hücre yoğunluğu için hücreleri uygun hacimdeki farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin (ör., 1 mL farklılaşma ortamında 2.5 x^{10 4} hücre).
   4. Bir mikropipet veya tekrarlayıcı pipet kullanarak, 20 μL hücre süspansiyonu damlacıklarını doku kültürü plakasının kapağına yerleştirin. Damlacıkların birleşmesini önlemek için birbirine çok yakın olmadığından emin olun.
      not: Damlacıklar, plakanın kendisine değil, kapağa yerleştirilecekleri için doku kültürü ile muamele edilmiş bir bağlantı plakası veya süspansiyon plakası üzerine kaplanabilir. Daha uygulanabilir ve steril bir yaklaşım için, damlacıkları bir ek doku kültürü plakası üzerine yerleştirin ve aşağıda açıklandığı gibi bir süspansiyon plakasına aktarın.
   5. Plakayı 5-10 mL 1x PBS ile doldurun ve kapağı dikkatlice tabağa geri koyun. Kültürü 37 °C inkübatörde inkübe edin.
      not: Damlacıkların kurumasını önlemek için kültür plakasına PBS eklenir.
3. 2. günde, damlacıkları kapaktan toplamak için bir mikropipet kullanın ve bunları 10 mL farklılaşma ortamı ile doldurulmuş 10 cm'lik bir hücre kültürü süspansiyon plakasına yerleştirin. Kültürü, inkübatörde düşük hızda çalkalanan bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
4. 4. günde, EB'leri hasat etmek için hücreleri toplayın, 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   not: EB'ler, sonraki deneylerin gereksinimlerine göre 1x PBS ile de yıkanabilir.
5. Prosedüre devam etmek ve nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) EB farklılaşmasını indüklemek için, farklılaşma ortamını 5 μM retinoik asit (RA) ile hazırlayın.
6. EB'leri 3 dakika boyunca 100 x g'da peletleyerek eski ortamı çıkarın veya eski ortamı aspire etmeden önce EB'lerin çökelmesine izin verin. Kültür plakasına 5 μM RA içeren 10 mL farklılaşma ortamı ekleyin.
7. 6. günde, plakayı eğerek ve ortamı yukarıda açıklandığı gibi pipetleyerek ortamın en az yarısını 5 μM RA içeren taze ortamla değiştirin.
   not: Ortamın en az yarısının 5. ve 7. günlerde taze RA içeren ortam ile değiştirilmesi önerilir. Fenol kırmızı göstergesine dikkat edin; Sarımsı hale gelirse, ortamın tamamını değiştirmek en iyisidir.
8. 8. günde, hücreleri toplayarak, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyerek ve süpernatanı çıkararak NPC'leri hasat edin.
   not: NPC'ler, sonraki deneylerin ihtiyaçlarına göre 1x PBS ile de yıkanabilir. Gerekirse, NPC'ler daha sonra kültür ve analiz için dondurulabilir ve tekrar çözülebilir. NPC'ler kültürlenecekse, akutaz tripsine alternatif olarak da kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.05 Tripsin + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-Özgeçmiş
% 0.1 Jelatin	Sigma	G1890-100G	Deiyonize suda hazırlanır
CHIR99021	Cayman Kimyasalları	13122
DMEM (Ömer Çiçeğ	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 orta	Thermo Fisher Bilimsel	11320033
EB tamponu	Keçi	19086
etanol	111000200	Eczacılık	Deiyonize suda seyreltilmiş
Fetal sığır serumu	Atlanta Biyoloji	S10250 Serisi
L-glutamin	Thermo Fisher Bilimsel	25030024
Lıf	Yok	Yok	MEF süpernatantından toplandı
MEM Esansiyel olmayan amino asitler	Corning	25-025-CL
PD0325901	Cayman Kimyasalları	13034
Penisilin / streptomisin	Corning	30-002-CL
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Yok	Yok	Deiyonize suda hazırlanır
Potasyum klorür	P217-500G	VWR (VWR)
Potasyum fosfat monobazik susuz	0781-500G	VWR (VWR)
Sodyum klorür	BP358-10	Fisher Biyoreaktifleri
Sodyum fosfat, dibazik, heptahidrat	SX0715-1	Milipore
Retinoik asit	Sigma	R2625 Serisi	DMSO'da hazırlanmıştır
Sodyum piruvat	Corning	25-000-Cl
β-merkaptoetanol	Fisher BiyoReaktifleri	BP176-100