Nöral Kök Hücrelerde siRNA Aracılı Gen Susturma

Özet

Kaynak: Nguyen, B. H., et al. O9-1 Nöral Krest Hücrelerinin Kültürlenmesi ve Manipülasyonu. J. Vis. Deneyim (2018)

Bu video, nöral kök hücrelerde ilgilenilen belirli genleri susturmak ve bunları uygun farklılaşma ortamı kullanarak istenen hücre tiplerine farklılaştırmak için küçük enterferans yapan RNA'nın (siRNA) kullanımını göstermektedir. Bu prosedür, nöral kök hücrelerin farklılaşma sürecinde belirli genlerin kritik rolünün incelenmesini sağlar.

Protokol

1. O9-1 hücrelerinin manipülasyonu

1. O9-1 hücrelerinde siRNA yıkımının gerçekleştirilmesi
   1. Deneye başlamadan önce 24 oyuklu bir plakayı bir bazal membran matrisi ile çözün ve kaplayın. O9-1 hücrelerini kurtarın ve tohumlayın, böylece %60 ila %80 birleşme noktasına kadar büyümelerine izin verin.
   2. Lipozomları serumsuz ortamda uygun kuyu hacmine göre seyreltin. siRNA'yı serumsuz ortamda finale kadar seyreltin. Seyreltilmiş lipozomlara üretici tarafından önerilen bir oranda seyreltilmiş siRNA ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve ardından inkübe edin.
      not: Kullanılan hacim, süre ve inkübasyon sıcaklığı ile ilgili üreticinin kılavuzunu izleyin.
   3. Üreticinin tavsiyelerine göre hücrelere uygun hacimde siRNA-lipid kompleksi ekleyin.
   4. Hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO₂) 24 saat inkübe edin. Aşağı akış adımlarını uygun şekilde gerçekleştirin (RNA'yı çıkarın, proteinleri çıkarın, boyama, vb.)
      NOT: siRNA yıkım süreleri ve konsantrasyonları, bireysel deneye bağlı olarak değişebilir.

2. O9-1 hücre farklılaşması

1. O9-1 hücrelerinin osteoblastlara farklılaşması
   1. Osteojenik farklılaşma ortamı hazırlamak için, aşağıdakileri alfa-MEM içinde seyreltin (nihai konsantrasyonlar belirtilmiştir): 0.1 μM deksametazon, 100 ng / mL kemik morfogenetik protein 2 (BMP2), 50 μg / mL askorbik asit, 10 mM b-gliserofosfat,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin.
   2. Şekil 1.
      'da gösterildiği gibi, farklılaşmış osteoblastlarda osteoblast belirteci osteokalsini immün boyama ile tespit edin NOT: Osteojenik farklılaşma, diğer osteoblast belirteçleri kullanılarak veya Alizarin kırmızı boyaması veya alkalin fosfataz boyaması ile de değerlendirilebilir.
2. O9-1 hücrelerinin düz kas hücrelerine farklılaşması
   1. Düz kas hücresi farklılaşma ortamı hazırlamak için, aşağıdakileri DMEM'de seyreltin (nihai konsantrasyonlar belirtilmiştir): 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve% 10 FBS.
   2. Şekil 2'de örnek olarak gösterilen düz kas hücrelerinin belirteçlerine karşı antikorlar kullanarak düz kas hücresi farklılaşmasını immünofloresan boyama ile değerlendirir.

Sonuçlar

Şekil 1: O9-1 hücrelerinin osteojenik farklılaşma koşulları altında osteoblast hücrelerine yol açtığını gösteren osteoblast belirteci osteokalsinin (Ocn) immünofloresan boyaması. Hücreler osteoblast markörü Ocn antikoru (yeşil) ile, çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Oklar Ocn pozitif hücreleri gösterir. Osteokalsin (Ocn, bir osteoblast belirteci); DAPI (′,6-diamidino-2-fenilindol)....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
O9-1 fare kraniyal nöral krest hücre hattı	Kırlangıç Sigma	SCC049
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok	Gibco (Gibco)	11960-044
DMEM, yüksek glikoz	Klon	SH30243.01
FBS (fetal sığır serumu)	Kırlangıç Sigma	ES-009-B
Penisilin - streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
L-glutamin 200mM (100X)	Gibco (Gibco)	25030-081
HBSS'de tripsin-EDTA %0.25	Genesee Bilimsel	25-510
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu)	Fransa	17-512F
MEM esansiyel olmayan amino asitler (MEM NEAA) 100X	Gibco (Gibco)	11140-050
Sodyum piruvat (100mM)	Gibco (Gibco)	11360-070
2-Merkaptoetanol	Sigma	M-7522
Rekombinant insan fibroblast büyüme faktörü-bazik (rhFGF-bazik)	Ar-Ge Sistemleri	233-FB-025
Mitomisin C	Roche	10107409001
Matrigel matrisi	Corning	356234
DMSO (dimetilsülfoksit)	Kırlangıç Sigma	MX1458-6
Lipofektamin RNAiMAX	Thermo Fisher Bilimsel	13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco (Gibco)	31985-070
Minimum esansiyel ortam, Earle tuzları, ribonükleozitler, deoksiribonükleozitler ve L-glutamin ile alfa 1X	Corning	10-022-Özgeçmiş
HEDEF ÜZERİNDEKİ Wwtr1 siRNA	Dharmacon Belediyesi	L-041057
ON-TARGETplus Hedefleme Dışı Havuz	Dharmacon Belediyesi	D-001810
ON-TARGETplus Yapı1 siRNA	Dharmacon Belediyesi	L-046247
FCS (fetal baldır serumu)
ITS (insülin-transferrin-selenyum)
TGF-b3
Askorbik asit
BMP2 (kemik morfogenetik proteini 2)
Deksametazon
B-27 takviyesi

Serisi arası Serisi Serisi Serisi Serisi