Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Varsayılan İndüklenmiş Nöral Progenitör Hücre (iNPC) Kolonilerinin İzolasyonu
- iNPC kolonilerini toplamadan bir gün önce, 48 oyuklu bir plakayı laminin ile kaplayın: laminini Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 1 μg / ml'ye seyreltin, plakalara 300 μl çözelti ekleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C'de tutun. Bir gün sonra, plakalardan laminini aspire edin ve 200 μl nöroindüksiyon ortamı ekleyin (1: 1 DMEM / F-12: Nörobazal, 1x N2, 1x B27,% 1 GlutaMAX, 10 ng / ml insan lösemi inhibitör faktörü, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) kuyucuklara.
- Toplanacak kolonileri içeren 6 kuyucuklu plakayı DPBS ile bir kez yıkayın ve 6 oyuklu plakanın her kuyucuğuna 2 ml nöroindüksiyon ortamı ekleyin. Kolonileri mekanik olarak toplayın: çevredeki hücrelerden kurtulmak için ince bir iğne kullanarak kolonilerin etrafını kazıyın; 200 μL'lik pipetleyiciyi 50 μL'ye ayarlayın ve ilgili pipet uçlarını kullanarak kolonileri toplayın.
- Her biri bir koloniyi laminin kaplı 48 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak tek hücreli bir süspansiyon oluşturun. Hücrelere 10 μM'lik bir son konsantrasyonda ROCK inhibitörü Y27632 ekleyin.
- 48 kuyulu plakadaki hücreleri 37 °C'de, %5 CO2'de 2 gün boyunca büyütün. Hücreler %80 - 90 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 3 - 4 gün) ortamı her iki günde bir değiştirin.
