$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Yüksek Yoğunluklu Nöron Kültürleri için 24 Kuyulu Plakaların Hazırlanması
>NOT: Planlanan embriyo hasadından bir gün önce aşağıdaki adımları (2-3) gerçekleştirin.
- İki adet 24 oyuklu plakayı hücre kültürü başlığına getirin ve ayrı ambalajı açın.
- 18 G'lik bir şırınga iğnesini 1 ml'lik plastik tek kullanımlık bir şırıngaya bağlayın.
- Şırıngayı tutun ve iğne ucunu kuyu tabanının ortasına ~ 1 mm sola doğrultun. Kuyunun dibini (~1 mm uzunluğunda) aşındırmak için orta kuvvet (~ 250 g) uygulayın. Bir oluk oluşturulacak ve yer değiştiren plastik malzemeler, düz tabanlı kuyu yüzeyinin üzerinde yükseltilmiş destek oluşturacaktır. Benzer şekilde tabanın merkezinin ~1 mm sağında ~1 mm uzunluğunda başka bir paralel oluk aşındırın.
- İki 24 oyuklu plakanın tüm kuyuları için bu adımı tekrarlayın. Yüksek yoğunluklu kültür için kullanılan iki adet 24 oyuklu plaka artık poli-D-lizin ile kaplamaya hazırdır (aşağıdaki adım 2.8'e bakın).
2. Düşük Yoğunluklu Nöron Kültürleri için Lamel Hazırlığı
- 12 mm çapında # 1 yuvarlak cam kullanın.
- 100 mm çapında steril plastik petri kabına 50 lamel yerleştirin ve lamelleri 20 ml %70 etanol çözeltisine batırın. Bu petri kabını bir saat boyunca orta (70 rpm) hızda dönen bir platforma yerleştirin. %70 etanolü çıkarın ve ardından yeni bir %70 etanol partisi ile değiştirin. Döndürün ve bir saat daha yıkayın.
- % 70 etanol temizleme solüsyonunu atın. Steril su ekleyin (0,2 μm filtre ünitesinden süzülür). Petri kabını elinizle döndürerek lamelleri sertçe durulayın. Üç kez durulayın, her seferinde taze steril su ile değiştirin.
- Lamelli petri kabını laminer akışlı steril bir hücre kültürü başlığının içine yerleştirin. Durulama suyunu vakum hattından aspire edin ve lamelleri daldırmak için 10 ml filtrelenmiş steril su ekleyin. Lameller steril olmalı ve yüzey poli-D-lizin kaplama için yeterince temiz olmalıdır.
- İki adet 24 oyuklu plakayı kendi ambalajlarından açın ve davlumbazın içine yerleştirin.
- Davlumbazdaki vakum hattını açın. Vakum hattına 200 μl'lik bir pipet ucu bağlayın ve daha büyük bir açıklık oluşturmak için ucu kesmek için bir makas kullanın.
- Petri kabından lamelleri teker teker almak için ince uçlu bir #5 cımbız kullanın ve lameli tamamen kurutmak için vakum hattını kullanın. Ardından, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir lamel yerleştirin. Temizlenmiş 50 lamel iki 24 kuyulu plakanın her bir kuyusunu doldurmak için yeterli olmalıdır.
- Poli-D-lizin stok çözeltisini (1 mg / ml) bir borat tamponu (pH 8.5) ile çalışan bir çözeltiye (0.1 mg / ml) seyreltin. Dört adet 24 oyuklu plaka için (tabanı kazınmış iki yüksek yoğunluklu plaka dahil), 30 ml toplam çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Cam lameller ile her bir oyuğa 300 μl 0.1 mg / ml poli-D-lizin iş çözeltisi ekleyin. Lamellerin tamamen çözeltiye batırıldığından emin olun. Değilse, lamelleri kuyunun dibine bastırmak için # 5 cımbız ucunu kullanın ve lamellerin tüm yüzeyini kaplamak için poli-D-lizin çözeltisini yönlendirmek için ucu kullanın. Plaka ile lameller arasında hava sıkışmadığından emin olmak için tüm lamellerin görsel olarak inceleyin.
- Tabanı kazınmış yüksek yoğunluklu kültür plakasının her bir oyuğuna 300 μl 0.1 mg / ml poli-D-lizin iş çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi kuyunun tüm tabanını kaplayacak şekilde yaymak için elle döndürün.
- Poli-D-lizin içeren dört plakayı da kültür inkübatörüne geri koyun ve O/N'yi inkübe edin.
3. Kültür için Yıkama ve Ön Koşullandırma Plakaları
>NOT: Aşağıdaki adımlar (3-5) doku alımının yapıldığı gün gerçekleştirilir.
- Lamellerin ve 24 oyuklu plakaların O/N inkübasyonundan/kaplanmasından sonra, dört plakayı da (ikisi donör lamelleriyle, iki tanesi kazınmış plastik tabanlı alıcı yüksek yoğunluklu plakalar) kültür başlığına getirin. Poli-D-lizin çözeltisini çıkarmak için vakum hattını kullanın.
- Poli-D-lizin çözeltisinin çıkarılmasının hemen ardından, plastik bir transfer pipeti kullanarak her kuyucuğa ~ 1 ml steril su ekleyin. Tüm kuyular su ile doldurulduktan sonra 10 dakika bekletin. Suyu vakumla çıkarın, ardından kuyunun dibini kaplamak için her kuyucuğa 300 μl Yıkama ortamı ekleyin (cam lameller olsun veya olmasın). Poli-D-lizin kaplamanın kurumasına izin vermeyin.
- Dört plakayı da hücre inkübatörüne geri koyun. Dağılmış hipokampal nöronlar hazırlandıktan sonra plakalar kullanıma hazırdır.
4. Nöronların Kaplanması ve Uzun Süreli Ko-Kültür
- Yüksek yoğunluklu nöronlar için kazınmış tabanlara sahip iki adet 24 oyuklu plakayı hücre kültürü başlığına getirin. 300 μl ön koşul ortamını vakumla çıkarın. Plaka 0.6 ml 250.000 nöron / ml'de yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonları.
- Diğer iki 24 oyuklu lamelli plakayı kültür davlumbazına getirin ve 300 μl ön koşul ortamını vakumla çıkarın. Plaka 0.6 ml düşük yoğunluklu hücre süspansiyonları 10.000 nöron / ml'de iki 24 oyuklu plakanın içindeki lameller üzerinde.
- Dört adet 24 oyuklu plakayı da inkübatöre geri koyun. 2 saat bekletin.
- Düşük yoğunluklu lamelleri, yüksek yoğunluklu kültüre yapışan nöronlarla çevirin. Nöronların birbirine baktığından emin olun (yani, cam lamel ile ayrılmamış). Daha sonra iki plakayı ko-kültür ile inkübatöre geri koyun.
5. Ortak Kültür Sürdürülebilirliği
- Günde in vitro (DIV) 300 μl taze Besleme ortamı (Malzemelere bakınız) ekleyerek ko-kültürleri besleyin 5. Diğer birçok çalışmada bildirildiği gibi, orijinal tam kültür ortamının% 50'sini çıkarmaya gerek yoktur. Besleme ortamı ayrıca glia kontaminasyonu ve proliferasyonu olasılığını en aza indirmek için 15 μM sitozin arabinosit (Ara-C, 5 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için) içerir.
- Bu ilk beslemeyi takiben, her hafta kuyuya 300 μl Ara-C içermeyen taze Yem ortamı ekleyin. Kültürün bir aydan fazla tutulması durumunda, ortamın yarısını bir aylık zaman noktasından sonra her hafta taze Besleme ortamıyla değiştirin (ilk ortamın yarısı DIV33'te değiştirilerek). Morfolojik olarak, hem yüksek yoğunluklu hem de düşük yoğunluklu nöronlar üç aya kadar sağlıklı görünür (deneyciler tarafından gözlemlenen en uzun süre).