İndüklenmiş Nöral Progenitör Hücrelerin Astrositlere Farklılaşması

Özet

Kaynak: Meyer, S., et al., Edenhofer, F. Yetişkin İnsan Fibroblastlarının Türetilmesi ve Genişletilebilir Nöral Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşümü. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, indüklenmiş nöral progenitör hücreleri (iNPC'ler) özel ortamlar kullanarak nöronlara ve astrositlere ayırma sürecini göstermektedir.

Protokol

1. iNPC'lerin farklılaşması

1. Nöronal soya doğru farklılaşma
   1. Yukarıda tarif edildiği gibi laminin kaplı plakalar üzerindeki kültür hücreleri. Hücreler yaklaşık% 70 birleştiğinde ortamı nöro-diff-media (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 μM C vitamini, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) olarak değiştirin. Üç hafta boyunca her gün medyayı değiştirin. Farklılaşma sırasında hücreleri bölmeyin.
   2. Üç hafta sonra, hücreler nöronal belirteç TUJ1'i eksprese etmelidir. Daha olgun nöronlar ve nöronal alt tipler kazanmak için farklılaşmaya 3 aya kadar devam edin.
2. Glial soya doğru farklılaşma
   1. Ortamı glial indüksiyon ortamına değiştirin (1: 1 DMEM / F-12: Nörobazal, 1x N2, 1x B27, 10 μM β-merkaptoetanol, 100 μM esansiyel olmayan amino asitler, 1.5 mM L-Glutamin, 5 μg / ml insülin, 40 ng / ml T3) glial öncü hücrelere farklılaşmayı indüklemek için 20 ng / ml EGF dahil. Ortamın yarısını çıkarın ve yaklaşık 2 hafta boyunca her gün yeni ortamla değiştirin. Bu süre zarfında,% 100 birleşmeye ulaşıldığında 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 varlığında hücreler 1: 3 oranında bölünmelidir.
   2. 2 hafta sonra, hücreleri astrositlere daha fazla farklılaştırın: hücreler neredeyse birleştiğinde, ortamı ticari olarak satılan astrosit ortamına değiştirin, ortamı her iki günde bir değiştirin. Yaklaşık 7 gün sonra, hücreler astrosit belirteçlerini (örneğin, GFAP) eksprese etmeye başlar. Farklılaşma protokolü sırasında hücreler %100 birleşirse, bunları 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 varlığında 1:2 oranında bölün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Astrosit ortamı	ScienCell (Bilimsel)	1801
B27	Yaşam Teknolojileri	17504-044
BDNF (BDNF)	Peprotech teknolojisi	450-02
kamp	Sigma	A6885
DMEM (Ömer Çiçeğ	Yaşam Teknolojileri	41966-029
DMEM F12	Yaşam Teknolojileri	11320-033
DMSO (Türkçe)	Roth	4720
DPBS (DPBS)	Yaşam Teknolojileri	14190-094
EGF (Türkçe)	Yaşam Teknolojileri	PHG0313
Fcs	Biochrom AG	50115
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	Peprotech teknolojisi	450-10
Insülin	Seralab Laboratuvarı	MÜCEVHER-700-112-P
L-Glutamin	Yaşam Teknolojileri	25030-024
Laminin	Sigma	L2020
N2	Yaşam Teknolojileri	17502-048
Nörobazal	Yaşam Teknolojileri	21103-049
Esansiyel olmayan amino asitler	Yaşam Teknolojileri	11140-050
C vitamini	Sigma	A4544
β-Merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985023

Yapımı Sertifikası Serisi Serisi adet Yılı Serisi