1. Genel Hususlar
- Gerekli reaktiflerin listesi için Malzeme/Ekipman Tablosuna bakın. Tüm adımları sıkı aseptik koşullar altında gerçekleştirin.
- FBS içeren tüm medya preparatları için ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (hiFBS) kullanın. Isıyla etkisiz hale getirmek için, 50 ml'lik bir FBS alikotunu 56 °C'de 30 dakika ısıtın, her 10 dakikada bir ters çevirin (ayrıca bkz. Tablo 1).
not: FBS, ısı inaktivasyonu olmadan kullanıldığında, epitel benzeri fenotip, SH-SY5Y hücrelerinin kültürleri boyunca daha hızlı ilerler.
- Kullanmadan önce, her adımdan önce uygun bir pH dengesi oluşturmak için ortamın bir inkübatörde ısınmasına ve dengelenmesine izin verin. Örneğin, 50 ml ortamın tamamen dengelenmesi yaklaşık bir saat sürer (pH 7, 37 °C, %5 CO2).
not: Bu protokol, kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin tripsinizlenmesini ve yeniden kaplanmasını gerektiren iki aşamalı bir bölme prosedürü kullanır. Bu, bu son derece kırılgan hücreler için stresli bir süreçtir. Bu nedenle, hücrelerin tripsin içinde minimum bir süre boyunca inkübe edilmesi önemlidir. Bu, nöronların tercihli olarak kaldırılmasına izin verecek ve epitel benzeri hücreleri hala yemeğe bağlı bırakacaktır.
- Farklılaşmış hücrelerin öğütülmesini, 10 ml'lik plastik bir pipetle, ucu hücreleri içeren konik tüpün dibine dayanacak şekilde yavaşça gerçekleştirin. Öğütme işlemini yavaş bir hızda, en fazla beş kez yukarı ve aşağı gerçekleştirin.
2. Çözülme ve Kültür Farklılaşmamış SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri
- Temel büyüme ortamını hazırlayın.
- Donmuş hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda (yaklaşık 2 dakika) hızla çözün
.
- Hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpte 9 ml Temel Büyüme Ortamında yeniden süspanse edin ve ardından 1.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
- Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 ml Temel Büyüme Ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
- Hücreleri bir T-25 şişesine veya 60 mm2 tabağa yerleştirin.
- Ertesi gün, ölü hücreleri çıkarmak için ortamı değiştirin.
3. Gün 0: Farklılaşma için Hücrelerin Kaplanması
- Farklılaştırma programı için Şekil 1'e bakın.
- Farklılaşmamış hücreleri 1x PBS ile durulayın, aspire edin ve ardından 1-2 ml ısıtılmış 1x% 0.05 Tripsin-EDTA kullanarak tripsine edin.
- Hücreler tripsin içindeyken, bir inkübatörde yaklaşık 3 dakika inkübe edin.
- 10 ml Temel Büyüme Ortamı ekleyerek tripsini söndürün, şişenin veya tabağın kenarlarını durulayın ve 1-3 kez hafifçe ezin. İçeriği 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
- 1.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı aspire edin.
- Peleti 5 ml Temel Büyüme Ortamında yeniden süspanse edin ve 1-3 kez ezin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından Temel Büyüme Ortamı kullanarak 50.000 hücre / ml'ye seyreltin.
- 35 mm2 tabak başına 2 ml hücre tabağı, tabak başına toplam 100.000 hücre olacak şekilde tabaklayın ve tekrar inkübatöre yerleştirin.
>4. 1. Gün: Medyayı Değiştir (Farklılaştırma Medyası #1)
- 50 ml Farklılaştırma Ortamı #1'i alın (Tablo 2'ye bakınız) ve 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
- Ortam ısıtıldığında, kullanımdan önce uygun bir pH dengesi oluşturmak için en az bir saat boyunca bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) dengelenmesine izin verin.
- Retinoik Asit (RA) (bkz. Tablo 1) bulaşıklara ortam eklemeden hemen önce ısıtılmış ve dengelenmiş ortama ekleyin.
not: Retinoik asit ışığa duyarlıdır ve 4 °C'de koyu renkli şişelerde saklanmalıdır
- Eski medyayı nazikçe aspire edin ve atın.
- 35 mm'lik2 tabak başına RA'lı 2 ml Farklılaştırma Ortamı #1 ekleyin ve inkübatöre geri dönün.
>5. 3. Gün: Medyayı Değiştir (Farklılaştırma Medyası #1)
- Bölüm 4'ü tekrarlayın (1-5. adımlar)
6. 5. Gün: Medyayı Değiştir (Farklılaştırma Medyası #1)
- Bölüm 4'ü tekrarlayın (1-5. adımlar)
>7. 7. Gün: Hücreleri Böl 1:1
- Bulaşıklara medya eklemeden hemen önce ısıtılmış ve dengelenmiş Farklılaştırma Ortamı #1'e RA ekleyin.
- Eski medyayı nazikçe aspire edin ve atın.
- 35 mm2 tabak başına 200 μl ısıtılmış% 0.05 1x Tripsin EDTA ekleyin ve bir inkübatörde yaklaşık 2-3 dakika veya mikroskop altında gözlemlendiği gibi hücreler plakadan gözle görülür şekilde kaldırılana kadar ısıtın.
- 35 mm'lik2 tabak başına RA ile 2 ml Farklılaşma Ortamı #1 ekleyerek tripsini söndürün ve kalan nöronal hücreleri plakadan durulamak için ortamı kullanın. Daha sonra içeriği 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
not: Tripsinizasyon adımları sırasında aynı anda çok fazla yemeği denemeyin. Bu, nöronal kültürlerin tripsin içinde çok uzun süre inkübe edilmemesini sağlamaya yardımcı olur, bu da sitotoksik olabilir.
- 50 ml'lik konik tüpte 10 tabağa kadar içeriği birleştirin ve 10 ml'lik plastik bir pipetle en fazla beş kez yavaşça yukarı ve aşağı hafifçe ezin.
- Aliquot 2 ml hücre süspansiyonu taze 35 mm2 tabak içine ve inkübatöre geri dönün.
8. 8. Gün: Medyayı Değiştir (Farklılaştırma Medyası #2)
- Bulaşıklara ortam eklemeden hemen önce ısıtılmış ve dengelenmiş ortama RA ekleyin (bkz. Tablo 1).
- Eski medyayı nazikçe aspire edin ve atın.
- 35 mm2 tabak başına RA ile 2 mL Farklılaştırma Ortamı #2'yi (Tablo 2'ye bakınız) yavaşça ekleyin ve inkübatöre geri dönün. Çabuk kuruyabilecekleri için nöronların uzun süre havaya maruz kalmasına izin vermeyin.
9. 9. Gün: Hücre Dışı Matriks (ECM) Kaplı Yemekler Hazırlayın
- Bir şişe ECM solüsyonunu buz üzerinde çözdürün ve 1:100 oranında soğuk DMEM'e seyreltin.
- Her 35 mm'lik2 tabağa 2 ml karışım dağıtın ve tabağın tüm tabanının kaplandığından emin olun.
- 1 saat veya gece boyunca bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin.
- Karışımı aspire edin ve bir davlumbazda yaklaşık 1 saat kurumaya bırakın. Oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın.
10. 10. Gün: Hücreleri ECM Kaplı Plakalara Aktarın 1:1
- Bulaşıklara ortam eklemeden hemen önce ısıtılmış ve dengelenmiş ortama RA ekleyin (bkz. Tablo 1).
- Ortamı nazikçe aspire edin ve atın.
- Her 35 mm'lik2 tabağa 200 μl ısıtılmış tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 1-2 dakika veya mikroskop altında gözlemlendiği gibi nöronlar tabaktan gözle görülür şekilde kaldırılana kadar inkübe edilmesine izin verin.
not: Nöronların tripsin ile aşırı inkübe edilmesini ve hasara neden olmasını önlemek için bu tripsinizasyon adımını oda sıcaklığında gerçekleştirin. Nöronlar bu aşamada plakalardan epitel benzeri hücrelerden çok daha hızlı salınır.
- 35 mm'lik2 tabak başına 2 ml Farklılaştırma Ortamı #2 ekleyerek tripsini söndürün ve ortamı plakadan kalan nöronal hücreleri durulamak için kullanın. Daha sonra içeriği 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
- 50 ml'lik konik tüpte 10 tabağa kadar içeriği birleştirin ve 10 ml'lik plastik bir pipetle en fazla beş kez yavaşça yukarı ve aşağı hafifçe ezin.
- 2 ml hücre süspansiyonunu ECM kaplı 35 mm2 tabağa dağıtın ve inkübatöre geri koyun.
11. 11. Gün: Medyayı Değiştir (Farklılaştırma Medyası #3)
- Bulaşıklara ortam eklemeden hemen önce ısıtılmış ve dengelenmiş ortama RA ekleyin (bkz. Tablo 1).
- Eski medyayı nazikçe aspire edin ve atın.
- 35 mm'lik 2 tabak başına RA ile 2 ml Farklılaştırma Ortamı # 3'ü (Tablo 2'ye bakınız) yavaşça ekleyin ve inkübatöre geri dönün. Nöronların uzun süre havaya maruz kalmasına izin vermeyin.
12. 14. Gün: Medyayı Değiştir (Farklılaştırma Medyası #3)
- Bölüm 11'i tekrarlayın (1-3. adımlar)
>13. 17. Gün: Son Medya Değişikliği (Farklılaştırma Medyası #3)
- Bölüm 11'i tekrarlayın (1-3. adımlar)
14. 18. Gün: Kullanıma Hazır Nöronal Kültürler
- Nöron sağlığını korumak için medyayı her 3 günde bir RA ile yeni Farklılaşma Ortamı #3 ile değiştirin.
not: Hücreler nöronlara farklılaşmalı ve nöronal bir fenotip sergilemelidir. Kültürler tipik olarak terminal farklılaşmayı takiben 14 güne kadar stabildir. Bununla birlikte, nöron canlılığının süresi, farklılaşmanın başlangıcında farklılaşmamış hücrelerin geçiş sayısına bağlıdır. Daha yüksek geçiş sayıları, daha kısa kullanım ömrüne sahip farklılaşmış nöronlar verir.
Tablo 1: Stok çözeltileri ve bileşenleri.
| parça | Şey | stok | Talimat -ları |
| 10 μM RA | All-trans retinoik asit | 5 mM | 33.3 ml% 95 EtOH'de 50 mg RA'yı yeniden süspanse edin. RA ısıya, ışığa ve havaya duyarlıdır. Koyu renkli bir şişede saklayın ve 4 °C'de 6 haftaya kadar saklayın. 1:500 seyreltmede kullanın ve kullanmadan hemen önce farklılaştırma ortamına seyreltin |
| (300,44 g/mol) |
| 1 adet B-27 | B-27 Takviyesi | 50 katı | 1-10 ml'lik şişeyi ve kalanını tek kullanımlık 1 ml'lik alikotlar halinde çözdürün ve -80°C'de saklayın. 10 ml'lik şişeleri -20 °C'de saklayın |
| 20 mM KCl | Potasyum Klorür | 1 M | 18,6 g KCl ve steril filtreye 250 ml su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın |
| (74,55 g/mol) |
| 2 mM db-cAMP | dibutiril döngüsel AMP | 1 M | 1 g db-cAMP'ye 2,04 ml su ekleyerek dolu şişeyi yeniden süspanse edin. Işığa ve neme karşı hassastır. -20 °C veya -80 °C'de 100 μl veya 200 μl'lik alikotlarda saklayın |
| (491,37 g/mol) |
| 50 ng/ml BDNF | Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) | - | Tozu dibe vurmak için şişeyi santrifüjleyin. 10 μg / ml elde etmek için 1 ml Neurobazal + 1x B27 veya 5 μg flakonu 0.5 ml Neurobazal + 1x B27'de 10 μg flakon yeniden süspanse edin. 1:200 seyreltmede kullanın. Çalışma alikotlarını -80 °C'de saklayın (örn: 250 μl) |
| hiFBS (İngilizce) | Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu | - | Aliquot, FBS'yi 50 ml'lik konik tüplere çözdürdü. 56 °C'de bir su banyosunda 30 dakika ısıtın. Çalışma alikotlarını -20 °C'de çıkarın ve dondurun |
Tablo 2: Medya tarifleri.
)
| >Temel Büyüme Ortamı |
| parça | 500 ml için hacim | Seyreltme |
| EMEM (EMEM) | 415 ml EMEM | |
| %15 yüksek FBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Kalem/Strep | 5 ml Kalem/Strep | 1:100 |
| 2 mM Glutamin | 5 ml Glutamin | 1:100 |
| *En fazla 6 hafta saklayın | |
| Farklılaştırma Ortamı #1 |
| parça | 50 ml için hacim | Seyreltme |
| EMEM (EMEM) | 48 ml EMEM | |
| %2,5 yüksek FBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Kalem/Strep | 500 μl Kalem/Strep | 1:100 |
| 2 mM Glutamin | 500 μl Glutamin | 1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (5mM stok) | 1:500 |
| *En fazla 2 hafta saklayın ve kullanmadan hemen önce RA ekleyin |
| *RA eklendikten sonra fazladan medya tutmayın - RA kararsız |
| Farklılaştırma Ortamı #2 |
| parça | 50 ml için hacim | Seyreltme |
| EMEM (EMEM) | 49 ml EMEM (EMEM | |
| %1 hiFBS | 500 μl hiFBS | |
| 1x Kalem/Strep | 500 μl Kalem/Strep | 1:100 |
| 2 mM Glutamin | 500 μl Glutamin | 1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (5mM stok) | 1:500 |
| *En fazla 2 hafta saklayın ve kullanmadan hemen önce RA ekleyin |
| *RA eklendikten sonra fazladan medya tutmayın - RA kararsız |
| Farklılaştırma Ortamı #3 |
| parça | 50 ml için hacim | Seyreltme |
| Nörobazal | 47 ml Nörobazal | |
| 1 adet B-27 | 1 ml B-27 (50X stok) | 1:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (1M stok) | 1:50 |
| 1x Kalem/Strep | 500 μl Kalem/Strep | 1:100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 μl GlutamaxI (100x stok) | 1:100 |
| 50 ng/ml BDNF | 250 μl BDNF stoğu (10 μg/ml) | 1:200 |
| 2 mM dibutiril döngüsel AMP (db-cAMP) | 100 μl db-cAMP (1M stok) | 1:500 |
| 10 μM RA | 100 μl RA (5 mM stok) | 1:500 |
| *En fazla 2 hafta saklayın ve kullanmadan hemen önce RA ekleyin |
| *RA eklendikten sonra fazladan medya tutmayın - RA kararsız |
