$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fare embriyonik kök hücre kültürü
- % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü kapları veya plakaları hazırlayın.
- 60 mm'lik hücre kültürü kaplarına 2 mL sterilize edilmiş %0,1 jelatin (suda %0,1 a/v) ekleyin. Hücre kültürü kaplarının eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için hafifçe sallayın.
- Bulaşıkları 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöre koyun ve 1 saat kaplamaya izin verin.
- Hücreleri tohumlamadan önce% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın.
not: Jelatini çıkardıktan sonra, kaplanmış bulaşıkları kurutmaya veya yıkamaya gerek yoktur.
- Fare embriyonik kök hücreleri (A2lox ve 129) kültürü
- %0.1 jelatin kaplı 60 mm hücre kültürü kaplarında mESC'leri (A2lox ve 129) hücrelerini, sırasıyla% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de mESC büyüme ortamında inkübe edin. mESC büyüme ortamı, %85 nakavt Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortam/besin karışımı F-12 (DMEM/F12), %15 Nakavt serum replasmanı (KSR), 0.1 mM β-merkaptoetanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, %1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA), %1 penisilin/streptomisin (P/S), 1000 U/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 inhibitörü) ve 0.33 nM PD0325901 (MEK inhibitörü).
DİKKAT: β-merkaptoetanol yanıcıdır ve soluma toksisitesine sahiptir. Yangın kaynaklarından uzak tutun ve kullanım sırasında solunmasını önlemek için maske takın.
- A2lox ve 129'un daha iyi büyümesi için mESC büyüme ortamını günlük olarak değiştirin.
- Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın ve tabağa 1 mL% 0.1 tripsin ekleyin. Tüm hücrelerde tripsinin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için 30 saniye boyunca hafifçe sallayın.
- Hücreleri tripsinize etmek için yaklaşık 1 dakika bekletin ve ardından 1 mL'lik bir pipet kullanarak tripsini çıkarın.
- Tabağa 2 mL mESC büyüme ortamı ekleyin, tek hücreli bir süspansiyon yapmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Bir hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin yoğunluğunu mümkün olduğunca doğru bir şekilde sayın.
- Hücreleri 7 gruba bölün ve Tablo 1'de gösterilen farklı protokolleri kullanarak farklılaşmayı indükleyin.
2. mESC'lerden NPC'lere farklılaşma
- % 0.1 jelatin kaplı hücre kültürü plakaları veya lameller hazırlayın.
- Kullanmadan önce, adım 1.1'deki gibi% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plakalar veya lameller hazırlayın.
- Farklılaşma (Tablo 1)
- % 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de embriyoid vücut oluşumuna izin vermek için 10 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yapışkan olmayan bir bakteri kabına 1.5 x10 6 mESC ekleyin.
- 2 gün sonra, hücre agregalarını 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve yerçekimi ile çökelmelerine izin verin.
- Süpernatanı çıkarın ve embriyoid cisimciklerini yeniden süspanse etmek için 10 mL taze bazal farklılaşma ortamı I ekleyin. Onları yapışkan olmayan yeni bir bakteri kabına tekrar dikin ve 2 gün daha farklılaşmasına izin verin.
- Mikroskop altında embriyoid cisimciklerinin oluşumunu kontrol edin (Şekil 1A).
- Embriyoid cisimciklerini 2.2.2-2.2.3 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. Oyuk başına 2 mL bazal farklılaşma ortamı I'de yaklaşık 50 embriyoid cisimciği% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plakalara tohumlayın.
- 1 mM all-trans retinoik asit (RA) stoğu (DMSO'da) hazırlayın ve alt paketlemeden sonra -80 ° C'lik bir dondurucuda ışıktan uzakta saklayın.
not: RA stabil değildir ve RA stoğunun hazırlanması sırasında ışıktan uzak tutulmasına ve hava temasının azaltılmasına dikkat edilmelidir.
- RA indüksiyonu için, 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğa 2 μL RA stoğu ekleyin.
- Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 4 gün daha ayırt edin.
- Her 2 günde bir 2 mL bazal farklılaşma ortamı I'in tamamını (1 μM RA ile) değiştirin.
Tablo 1: Farklılaşmada kullanılan protokolün detayları.
| protokol | medya |
| 4 günlük Embriyoid Cisimler oluşumu + 4 günlük RA indüksiyonu | Bazal farklılaşma ortamı:
DMEM / F12 +% 15 FBS +% 1 NEAA + 0.1mM 2ME +% 1 P / S |
