Nöral Progenitör Hücrelerin Nöronlara Farklılaşması

Özet

Kaynak: Mao, X., et al. Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden İn vitro Nöronal Farklılaşma. J. Vis. Uzm. (2020).

Video, nöral progenitör hücreleri nöronlara ayırmak için bir hücre kültürü yöntemini gösterdi. Hücreleri, büyüme faktörleri ile desteklenmiş, besin açısından zengin bir ortamda inkübe ederek, progenitör hücreler, gelişmiş aksonlar ve dendritler ile nöronlara olgunlaştı. Stabilize edici bir ajan, hücre canlılığını sağladı ve farklılaşma süreci boyunca oksidatif hasara karşı koruma sağladı.

Protokol

>1. NPC'lerden nöronlara farklılaşma (Faz II)

1. %0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu plakalara oyuk başına 2 mL bazal farklılaşma ortamı I içinde yaklaşık 5 x^{10 5} fare embriyonik kök hücrelerini veya mESC türevlerini tohumlayın. mESC türevlerini sırasıyla Faz II protokol 1, protokol 2 ve protokol 3 olmak üzere rastgele 3 gruba ayırın.
2. Plakayı, 6 saat boyunca tutturmaya izin vermek için 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin. 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
3. Yukarıdaki grupların her bir oyuğuna sırasıyla 2 mL bazal farklılaşma ortamı I, N2B27 orta I ve N2B27 orta II (Tablo 1) ekleyin.
4. Plakaları inkübatöre yerleştirin ve 10 gün daha farklılaşmalarına izin verin. İlgili ortamı her 2 günde bir değiştirin.
5. Farklılaşma durumunu kontrol edin ve 3. adımda belirtildiği gibi morfolojik değişiklikleri kaydedin.
6. 18. Günde, nöronların oluşumunu değerlendirin (β-Tubulin III pozitif) ve adım 4'te kullanılan 3 protokolün farklılaşma verimliliğini belirleyin.

Sonuçlar

Tablo 1: Faz II farklılaşmasında kullanılan 3 protokolün detayları.

Farklılaşma Fazı II (10d)
	Protokol	medya
Protokol 1	Doğal olarak farklılaşma: Bazal farklılaşma ortamı ile sadece I	Bazal farklılaşma ortamı I: DMEM / F1...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tavşanda üretilen anti-β-Tubulin III antikoru	Sigma Aldrich	T2200	-80 °C'de saklanır, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önler
B-27 Takviyesi (50X), serumsuz	Gibco (Gibco)	17504044	-20 °C'de saklanır ve ışıktan korunur
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone (Klon	SH30023.01B	4 °C'de saklanır
Fetal sığır serumu	HyClone (Klon	SH30084.03	-20 °C'de saklayın, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önleyin
Floresan mikroskobu	Olympus	CKX53
jelatin	Gibco (Gibco)	CM0635B	oda sıcaklığında saklanır
GlutaMAX Takviyesi	Gibco (Gibco)	35050061	4 °C'de saklanır
İmmünol Boyama Primer Antikor Seyreltme Tamponu	Beyotime	P0103 Serisi	4 °C'de saklanır
Nakavt DMEM/F-12	Gibco (Gibco)	12660012	4 °C'de saklanır
MEM Esansiyel olmayan amino asit çözeltisi	Gibco (Gibco)	11140076	4 °C'de saklanır
N-2 Takviyesi (100X)	Gibco (Gibco)	17502048	-20 °C'de saklanır ve ışıktan korunur
Normal keçi serumu	Jackson	005-000-121	-20 °C'de saklanır
Nörobazal Orta	Gibco (Gibco)	21103049	4 °C'de saklanır
Yapışkan olmayan bakteri kabı	Corning	3262
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1X)	HyClone (Klon	SH30256.01B	4 °C'de saklanır
Penisilin / Streptomisin Çözeltisi	HyClone (Klon	SV30010	4 °C'de saklanır
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck Belediyesi	S1036 Serisi	-20 °C'de saklanır
Retinoik asit	Sigma	R2625 Serisi	-80 °C'de saklanır ve ışıktan korunur
Suş 129 Fare Embriyonik Kök Hücreleri	Siyagen	MUAES-01001	Besleyici içermeyen kültür sisteminde muhafaza edilir
2-Merkaptoetanol	Gibco (Gibco)	21985023	4 °C'de saklanır ve ışıktan korunur
% 4 paraformaldehit	Beyotime	P0098 Serisi	-20 °C'de saklanır
6 - kuyu plakası	Corning	3516
60 mm hücre kültürü kabı	Corning	430166
15 ml santrifüj tüpü	NUNC (Ulusal Kızılderili	339650

· Serisi ) ) Serisi ) ) )