Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Duyusal Ganglion Ayrışması
- 500 μl Ganglion Ayrışma Solüsyonunu (GaDS) (Tablo 1) pipetleyin ve gangliyonları tüpte bırakın. 1 ml Fosfat tampon çözeltisi (PBS) ekleyerek gangliyonları bir kez yıkayın, ganglionların tüpün dibine çökmesini bekleyin ve ardından PBS'yi pipetleyin.
- Her tüpe 1 ml GaDS ve 22 μl sindirim enzimi (kollajenaz I/II ve proteaz karışımı, su içinde 2.5 mg/ml) ekleyin.
- Pozitif kontrol tüpüne 20 μl Fast Blue (5.26 mM) ekleyin.
- Tüpleri 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna veya ısıtma bloğuna koyun.
- Her 15 dakikada bir, tüpleri kısa bir süre çalkalayın ve ganglionların solüsyonla kaplandığından emin olmak için hafifçe vurun.
not: Ganglionların sindirim zamanı, sindirim enziminin yaşına bağlıdır. Sindirim enziminin çözülmesinden sonraki bir ay içinde 30 dakika sindirin; 2-6 ay içinde 45 dakika sindirin. Enzim altı aylıktan daha eskiyse, gangliyonları 60 dakika boyunca sindirin.
- Ganglionlar sindirilirken, bir parçacık çözeltisi (polivinilpirolidon ile kaplanmış kolloidal silika parçacıkları) kullanarak yoğunluk gradyanları hazırlayın.
- GaDS'de% 12 partikül çözeltisini, numune başına 500 μl karıştırın.
- %28 partikül çözeltisini GaDS'de, numune başına 500 μl'de karıştırın.
- Her numune için 1,5 ml'lik taze bir tüpte 400 μl% 28 yoğunluklu çözeltinin üzerine 400 μl% 12 yoğunluklu çözeltiyi yavaşça ve dikkatlice ekleyin. İki katmanın karışmasına izin vermeyin. Tüpte biri diğerinden daha koyu olan iki farklı katman görünmelidir.
- Uygun sindirim süresinden sonra, GaDS'yi sindirim enzimi ile çıkarın ve gangliyonları 1 ml PBS ile iki kez yıkayın. Her tüpe 200 μl taze GaDS ekleyin.
- 100 μl hacme ayarlanmış 200 μl'lik bir pipet kullanın ve hücreleri ayırmak için gangliyonları birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Sağlam bir doku parçası görülmeyene kadar tekrarlayın. Solüsyonda kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
- Ayrışmış hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
- Kalan başıboş hücreleri almak için orijinal ayrışma tüpüne 100 μl GaDS daha ekleyin ve ek çözeltiyi hücre süzgecinden geçirin. Yeni bir pipet ucu kullanarak, süzgeçten geçen ve ağa yapışan kalan hücre içeren sıvıyı toplayın. GaDS'de süspanse edilen hücrelerin son hacmi 300 μl'dir.
- 300 μl'lik hücreleri önceden yapılmış yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice yerleştirin. Kabarcıklardan ve hücrelerin yoğunluk katmanlarıyla karışmasından kaçının.
- RT'de 2.900 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, üstteki 700 μl'lik tabakayı dikkatlice çıkarın ve atın. Bu katman, aksi takdirde hücre sıralamasına müdahale edecek hücre kalıntılarının çoğunu içerir.
- Çözelti içeren kalan hücreye 700 μl taze GaDS ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- 18. Pelet hücrelerine 2.900 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
- 19. Santrifüjleme yapıldıktan sonra, hücre peletini bırakarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
Birkaç - kez 200 μl'ye ayarlanmış 1.000 μl'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 200 - 300 μl GaDS'de yeniden süspanse edin. Örnekleri buzun üzerine koyun.
Tablo 1. Ganglion ayrışma çözeltisi (GaDS) için reaktif karışımı.
| malzeme | miktar |
| Gelişmiş DMEM/f12 | 9,5 ml |
| Glutamine | 100 μl |
| HEPES (10 mM) | 100 μl |
| N2 takviyesi | 100 μl |
| B27 (A vitamini yok) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | 10 μl |
