Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Aşağıdaki protokol, hipokampal dilimlerin uzun süreli inkübasyonu ve aralıklı görüntülenmesi için hazırlık ve kültür yöntemini açıklamaktadır. Tek bir hipokampal dilim, bir plazma pıhtısı kullanılarak özel olarak hazırlanmış bir foto oyulmuş lamel üzerine tutturulur ve daha sonra lameller, bir silindir inkübatörde tutulan delinmiş bir silindir tüpünün düz tarafına kapatılır.
1. Makaralı Tüp Rafının Hazırlanması
- Şekil 1A'da gösterilen şablonu, ölçek çubuğunda gösterilen boyuta göre yazdırılmış olarak kullanın. Bir çiviyle, deliklerin ortasındaki şablonda küçük delikler (ince bir nokta işaretleyici için yeterince büyük) açın.
- Şablonu 15 cm'lik bir doku kültürü kabının (nominal çap 14 cm) altına yerleştirin ve deliklerin konumunu işaretleyin. Bunu ikinci bir tabakta tekrarlayın.
- Plastik üzerinde kullanılmak üzere tasarlanmış matkap uçlarıyla, delik merkezleri tabağın kenarından 2,5 cm uzakta olacak şekilde altıgen bir dizide (merkezden merkeze 4,8 cm) her bir tabağa altı adet 1,5 cm çapında delik açın. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, daha büyük deliklerden ikisi arasına eşit uzaklıkta yerleştirilmiş kenardan 12 mm uzaklıkta üç delik (1 mm çapında) açın.
- Her bir tabağın alt kısımları birbirine bakacak şekilde, 2,5 inç uzunluğunda bir makine vidası (3/16 inç çapında) yerleştirin ve küçük deliklerden birinden düz bir rondela ve ardından ikinci bir düz rondela, bir parça polietilen boru (ara parça, 4,7 cm), başka bir düz rondela, ikinci doku kültürü kabı, başka bir düz rondela, bir kilitleme rondelası yerleştirin, ve bir fındık.
- Diğer iki makine vidası için 1.4 adımını tekrarlayın ve tüm makine vidaları yerine oturana kadar sadece gevşek bir şekilde sıkın. Ardından somunları iyice sıkın.
- Son makaralı boru rafını elde etmek için rondelaları (5/16 inç kalınlığında, 5/8 inç delik çapı) alt tabağın deliklerine yerleştirin (Şekil 1B; yerinde iki tüp ile gösterilmiştir). Her rafa benzersiz bir numara ile bir çıkartma yapıştırın.
2. Makaralı Tüplerin ve Lamellerin Hazırlanması
- Silindir borularda delik açmak için aparatın yapılması
- 1.5 x 8 x 2 inçlik bir ahşap bloğun orta tarafına 4 cm derinliğinde 5.5 cm'lik bir delik açın, makaralı borunun düz tarafı yerleştirildiğinde bloğa neredeyse paralel olacak şekilde bir açıyla (Şekil 2A).
- Borunun yerleştirilmesine izin vermek için deliği hem genişletmek hem de sivriltmek için yuvarlak bir ahşap eğe kullanarak deliği büyütün (makaralı boruların çapı kapak ucunun yakınında biraz daha büyüktür) (Şekil 2B).
- Bloğun yanından 1.5 cm uzakta ve yan deliğin üzerinde ortalanmış 5.5 cm çapında dikey bir delik açın (Şekil 2C).
- Yan delik yeterince sivrildiğinde, dilim için deliği ortalamak için istenen noktada işaretlenmiş bir silindir tüp yerleştirin ve tüpü, işaretli nokta 1.5 cm'lik dikey delikte ortalanacak şekilde konumlandırın.
- Tüpü çıkarın ve noktadan tüpün sonuna kadar olan mesafeyi ölçün. Mastardaki deliğin merkezinden bu mesafeyi işaretleyin ve boruyu delme için doğru şekilde konumlandırmak üzere bir durdurma sağlamak için bir çivi yerleştirin (Şekil 2C'deki ok).
- Yaralanmayı önlemek için çiviyi ahşap bloğun yüzeyiyle aynı hizada kesmek için bir demir testeresi kullanın.
- Sabitlenmesine izin veren yuvalara sahip bir matkap presi varsa, aparatın altına yaylı klipsler ekleyin (Şekil 2D siyah ok). Aksi takdirde, mastarı matkap presine güvenli bir şekilde tutmak için C-kelepçeleri kullanın.
- Düz kenarlı 11 cm'lik bir plastik kültür tüpünü düz tarafı yukarı bakacak şekilde tutmak ve konumlandırmak için yukarıda açıklanan aparatı kullanarak (Şekil 2A), merkezi alttan 6 cm uzakta ve tüpün kenarları arasında ortalanmış olarak 1.0 mm çapında bir delik açın.
not: Plastik için tasarlanmış bir matkap ucu kullanılmalıdır.
- Döner bir çapak alma aleti ile deliğin kenarlarını düzeltin (Şekil 2E) ve dönüş sırasında deliğin boşaltılmasını kolaylaştırmak için deliğin iç kenarında 4 oluk açın (Şekil 2E, iç kısım).
- 12 mm'lik bir delgeçle, toksik olmayan çift taraflı yapışkan silikon kauçuk levhalardan 12 mm çapındaki diskleri kesin. Standart tek delikli kağıt zımba (6 mm çap) kullanarak, her diskin ortasında bir delik açın.
- Delinmiş tüpleri %70 etanol ile durulayın, biyolojik güvenlik kabininde havayla kurutun ve tüpleri ve delikli yapışkan diskleri biyolojik güvenlik kabinindeki ultraviyole (UV) lambası (ortalama 70 cm mesafede 30 W) altında 40 dakika sterilize edin.
- Tüpleri ve diskleri 20 dakika sonra yeniden konumlandırın, böylece açıkta kalan tüm yüzeyler sterilize edilir. Steril koşullar altında, yapışkan bir diskten beyaz desteği soyun ve silikon kauçuğu, delikleri hizalayarak bir tüpün dışına yapıştırın (Şekil 2F).
Dikkat: UV ışınlarına maruz kalmamak için UV lambasını açmadan önce göz koruması kullanın ve kabini kapatın.
- 12 mm çapında fotogravürlü (100 merkez numaralı 1 mm kare) Alman cam lamellerin temizliği. Lamelleri forseps ile nazikçe tutun ve mutlak etanole, ardından suya, ardından tekrar mutlak etanole batırın ve son olarak etanolü yakmak için lamelleri aleve batırın. Lamellerin soğumasına izin verin.
- Lamelleri forseps ile tutarak, 10 saniye boyunca asetonda% 2 3-aminopropiltrietoksisilan içine daldırın. Lamelleri ultra saf suyla durulayın ve kurumaya bırakın.
- Lamelleri biyolojik güvenlik kabininin içindeki steril filtre kağıdına yerleştirin ve UV ışığını açın. Lamellerin her iki tarafını 20 dk.
maruz bırakın
Dikkat: UV ışınlarına maruz kalmamak için UV lambasını açmadan önce göz koruması kullanın ve kabini kapatın.
>3. Hipokampal Dilim Hazırlama
- Diseksiyona başlamadan önce, doku kıyıcı için çift kenarlı tıraş bıçaklarının yarısını hazırlayın. Bıçakları parmaklarınızla uzunlamasına dikkatlice katlayın ve ikiye bölün.
- Bıçak yarımlarını temizlemek için bir pamuklu çubuk kullanarak asetonla durulayın, ardından mutlak etanolde durulayın ve havayla kurutun. Doku kıyıcıya yarım bıçak takmadan önce,% 70 etanol ile durulayarak sterilize edin.
- Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokolleri takip edin; İzofluran anestezisinden sonra, 4-7 günlük bir fare veya sıçan yavrusunu dekapitasyon ile ötenazi yapın ve kafasını makas veya giyotin ile çıkarın.
not: Beyin dilimi kültürü protokolü, fare veya sıçan suşundan veya genotipinden bağımsızdır. Farklı genetik geçmişlere sahip birçok transgenik fare hattı kullanılmıştır.
- Kafayı %70 etanol ile durulayın ve 60 mm'lik bir Petri kabına koyun. Beyin diliminin silindir tüpüne son montajına kadar, steriliteyi korumak için aşağıdaki adımların tümü bir laminer akış başlığında gerçekleştirilir.
- # 21 cerrahi bıçak kullanarak, deriden ve kafatasından sagital bir kesik yapın. # 5 Dumont forseps ile beyni açığa çıkarmak için cildi ve kafatasını soyun.
- Kapalı forsepslerle, tüm beyni nazikçe kızdırın ve serebellumun arkasındaki beyin sapından forseps ile sıkıştırarak serbest bırakın. Beyni 4 °C Gey'in Dengeli Tuz Çözeltisi /% 0.5 glikoz (GBSS / glikoz) içeren 60 mm'lik steril bir tabağa yerleştirin.
- Beyni görselleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak (Şekil 3A), beynin sırt tarafını yukarı yerleştirin ve beynin ön üçte birlik kısmını ve beyinciği cerrahi bir bıçakla kesin (Şekil 3B).
- Forseps ile, stabilite için kesilmiş beynin arka tarafı yukarı ve ventral tarafı Petri kabının kenarına doğru tutun. Sagital orta hattın etrafındaki meninksleri nazikçe uzaklaştırın ve ince uçlu bir Dumont #5 forseps kullanarak orta beyin dokusunu çıkarın (Şekil 3C, kesikli daire).
- Açmak için beynin yan tarafı boyunca iki kesik yapın (Şekil 3C, kesikli çizgiler). Beyin sırt tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirildikten ve açıldıktan sonra, hipokampal fissür görünür olmalıdır (Şekil 3D, ok).
- Yayılmış açık beyni bir parça poliklorotrifloroetilen plastik filme aktarın ve bir doku kıyıcı sahnesinde dilimlemek için konumlandırın. Bıçağı GBSS/glikoz ile ıslatın ve hipokampusu ~ 300 μm kalınlığında dilimler halinde doğrayın.
- Bir transfer pipeti ile dilimlenmiş beyni plastik filmden GBSS/glikoz içeren 60 mm'lik yeni bir tabağa yıkayın (Şekil 3E). İnce uçlu forsepsler, kalan meninksler ve diğer hipokampal olmayan dokuları (Şekil 3F) dilimlerden (Şekil 3G, H) nazikçe sıkıştırın ve uzaklaştırın.
4. Kaplama Dilimleri
- Dilimler elde edildikten sonra, hazırlanmış bir lamel ile foto kazınmış tarafın ortasına 2 μL tavuk plazması yerleştirin. 3-4 mm çapında bir nokta elde etmek için plazmayı hafifçe yayın.
not: Fotoğrafla oyulmuş taraf, sayıların doğru yönlendirileceği şekilde bir diseksiyon mikroskobu ile bakıldığında lamellerin üst tarafıdır.
- 1 beyin dilimini steril dar uçlu bir spatula ile (Şekil 4A) plazma noktasına aktarın (Şekil 4B). Dilimi GBSS/glikozdan kaldırırken dilimi spatula ucunda tutmak için kapalı forseps kullanın.
- Spatulayı lamel üzerindeki plazma noktasına dokundurun ve kapalı forseps ile dilimi lamel üzerine itin.
- Ayrı bir tüpte 2.5 μL plazma ile 2.5 μL trombin karıştırın. Bu karışımdan 2,5 μL'yi dilimin üzerine ve etrafına hızlıca yerleştirin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin (Şekil 4B).
not: Plazma 10-15 saniye içinde pıhtılaşacaktır, bu nedenle bu hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Dilim yapışmasında bir sorun varsa, 5 μL plazmayı 5 μL trombin ile karıştırın ve dilim üzerinde 4-5 μL kullanın, karıştırdıktan sonra bir kısmını çıkarın, böylece dilim lamel üzerinde düz duracak.
- Daha önce bir rulo tüpe yapıştırılmış olan silikon kauçuk yapıştırıcının açıkta kalan tarafındaki şeffaf plastik kaplamayı çıkarın ve lameli beyin dilimi ile birlikte dilimi deliğin içinde hizalayarak yapıştırıcının üzerine yerleştirin (Şekil 4C).
- Yapışmayı sağlamak için, lameli eşit şekilde aşağı bastırarak ve biyolojik güvenlik kabinine aktarırken yaklaşık 1 dakika tutarak lamel üzerine başparmağınızla yumuşak, eşit bir baskı uygulayın.
- Biyolojik bir güvenlik kabininde, her tüpe 0.8 mL tam Nörobazal A kültür ortamı (Malzeme Tablosu) ekleyin (Şekil 4D).
- %5 CO%2/95 hava karışımını bir kelepçe ile güvenli bir şekilde tutulan steril pamuk tıkalı Pasteur pipetinden geçirin. Silindir borusunu gaz karışımıyla yıkayın ve pipetin etrafından çekilirken tüpü hızla kapatın.
- Tüpleri dilim numarası ve raf numarası ile etiketleyin. Tüpleri geometrik olarak dengeli olduklarından emin olarak bir makara rafına yerleştirin. Tek sayıda tüp varsa, dengelemek için tüpler ekleyin.
- Rafları, makaralı rafı yaklaşık 35-10 Devir (RPH) hızında çeviren silindirlerle 13 °C'lik bir makaralı inkübatöre yerleştirin (Şekil 4E). Ortamı tüplerin dibinde tutmak için, bir tahta üzerinde önünü kaldırarak inkübatörü yaklaşık 5° geriye doğru eğin.
