1. Mikroakışkan Cihazlar Kullanılarak Nöronal Kültürlerin Standardizasyonu: Cihaz Montajı
- İstenen deney için uygun bir mikroakışkan cihaz seçin. Aynı popülasyondaki nöronları bağlamak için Nöro Cihazları kullanın (Şekil 1) ve farklı popülasyonlardaki nöronları bağlamak için Ko-Kültür Cihazlarını kullanın (Şekil 2).
- İstenilen sayıda steril lamelleri veya cam tabanlı tabakları temizleyin ve hazırlayın. Plastik yüzeylerde en iyi sonucu elde etmek için 35 mm'lik tabaklar, cam üzerine 25 mm'lik lameller veya 35 mm cam tabanlı tabaklar kullanın. Görüntüleme sistemine göre cam kalınlığını seçin, örneğin 0,15 mm.
- Bulaşıkları veya lamelleri 0,5-1 mL 100 μg/mL PDL ile 2 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kaplayın.
not: Protokol burada duraklatılabilir ve istenirse ertesi gün devam ettirilebilir. Dahası, bulaşıklar borat tamponu ile seyreltilmiş PDL, Poli-L-Lizin (PLL), laminin veya başka herhangi bir hücre yapışma molekülü ile kaplanabilir.
- Bulaşıkları iki kez suyla yıkayın (tuz kristalleri kanalları tıkayabileceğinden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanmayın), tüm sıvıyı çıkarın ve biyogüvenlik kabini gibi steril bir ortamda 5-10 dakika veya yüzey tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın.
not: Lamellerin kesinlikle kuru olduğundan emin olun, çünkü kalan herhangi bir sıvı mikroakışkan sistemlerin yapışmasını engelleyecektir.
- Mikroakışkan cihazları, desenleri UV ışığı altında yukarı bakacak şekilde steril bir ortama (biyogüvenlik kabini) 10 dakika boyunca yerleştirin. Biyogüvenlik kabininde çalışırken steril prosedürleri uyguladığınızdan emin olun10.
- Cımbız kullanarak, temiz lamel / tabak ile temas edecek şekilde aşağı bakacak şekilde bir desen olan mikroakışkan bir cihaz yerleştirin. Cihazı cama yapışacak şekilde yumuşak bir şekilde bastırmak için cımbızı kullanın.
not: Yapıştırılan bölgenin şeffaflığı, ışığa karşı bakıldığında görünür olacaktır. Tüm köşelerin camla temas halinde olduğundan emin olun. Bunu tüm mikroakışkan cihazlara yapın. Şekil 1a'ya bakın.
- Tek popülasyonlu cihazı besiyeri ile doldurmak için, pipeti kanallara doğru tutun ve serumsuz B-27 (hacim oranı 1:50) ve 500 μg/mL penisilin/streptomisin/glutamin (topluca NBM olarak adlandırılır) ile desteklenmiş 50 μL tam hücre ortamı ekleyin sağ üst kuyucuğa ve ardından çapraz olarak uzanan kuyuya 50 μL daha ekleyin. Bunu tüm cihazlar için yapın ve ortamın kuyular arasında aktığından emin olun. Daha sonra, kalan iki kuyucuğa 50 μL orta ekleyin. Şekil 3a'ya bakın.
- Çoklu popülasyon cihazını ortamla doldurmak için pipeti kanallara doğru tutun ve doğru kuyucuklara 30 μL tam NBM ekleyin, Şekil 2a'ya bakın. Bunu tüm cihazlar için yapın ve ortamın kuyular arasında aktığından emin olun. Daha sonra, kalan dört kuyucuğa 50 μL orta ekleyin.
- Cihazları otoklavlanmış su (ıslak hazne) ile açık bir tabak ile daha büyük bir tabağa yerleştirin ve hücre kültürünü hazırlarken 1-2 saat inkübatöre (37 °C, %5 CO 2 ve %95 nem) yerleştirin. Şekil 3b'ye bakın.
2. Mikroakışkan Sistemlerde Kaplama Nöronları
- Bir protokolü takiben, Sprague Dawley sıçan embriyolarından (her iki cinsiyet) ayrışmış hipokampal veya kortikal nöronlar elde edin.
- NBM'deki embriyonik nöronları 1-2 milyon nöron / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak ve referansı takip ederek mikroskopta hücre konsantrasyonlarını doğrulayın8. Hücre konsantrasyonunu istenen hücre yoğunluğuna göre ayarlayın. Kanal başına tek hipokampal akson elde etme şansını artırmak için, cihaz başına 10.000 nöron plaka. Aynı kanalda birden fazla aksona sahip olmak için, cihaz başına 60.000 nöron plakalayın.
Not: Bu sayılar kullanılan nöronal tipe göre değişir.
- Kuyuları boşaltmadan ortamı mikroakışkan cihazlardan çıkarın. Her birinde yaklaşık 5 μL bırakın.
- Tek popülasyonlu cihazdaki hücreleri plakalamak için, sağ alt kuyucuğa 50 μL NBM ekleyin. Bu noktada, ortam diğer alt kuyuyu doldurmak için kendi kendine akar. Şekil 1b'de gösterildiği gibi mikroakışkan cihazın sağ üst kuyucuğuna 20 μL konsantre hücre çözeltisi ekleyin.
- Çoklu popülasyon cihazındaki hücreleri plakalamak için, Şekil 2a'daki sağ kuyucukların her birine 20 μL konsantre hücre çözeltisi ekleyin.
- Hücrelerin odaların içinde olup olmadığını mikroskopta kontrol edin ve hücrenin substrata bağlanmasını teşvik etmek için cihazları 15-30 dakika inkübatöre yerleştirin.
- Odalarda yeterli hücre olup olmadığını mikroskopta kontrol edin. Daha fazlasına ihtiyaç duyulursa, 2.4 ve 2.5 adımlarını tekrarlayın.
- Tek popülasyon cihazının en üstteki 2 kuyucuğuna 50 μL NBM ekleyin ve hücreler çoklu popülasyon cihazına enjekte edilirken aynı kuyuya 20 μL NBM ekleyin. Medya, pozitif bir menisküs oluşturmak için hafifçe çıkıntı yapar ve kuyucuklara bir çörek üst görünümü verir. Yine, Şekil 3a'ya bakın.
- Hücreleri 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde tutun.
3. Nöronal Kültürlerin Bakımı
- NBM'yi (bir pipetle yaklaşık 30 μL) hücrelerden çıkarın ve cihazlara girişlerinden sonraki gün (yani 2. adımdan 1 gün sonra) yeni önceden ısıtılmış NBM uygulayın.
- Her kanalda yeterli ortam olup olmadığını 2 günde bir kontrol edin. Muffin üstü düşükse, üst kuyucuklara daha fazla orta ekleyin.
- Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından önce en az 7 gün boyunca kültür hücreleri. Hücreler bu cihazlarda birkaç hafta hayatta kalabilir. Numuneler üzerinde deneyler yapılmadan 1-2 gün önce cihazları çıkarın.
4. Mikroakışkan Cihazların Çıkarılması
- Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından 1 - 2 gün önce, her numune kabına 37 °C'ye önceden ısıtılmış 2 mL NBM ekleyin, hazneleri doldurun ve cihazları inkübatörde tutun.
- Steril cımbız ve bir uç kullanarak mikroakışkan cihazları lamellerden çıkarın ve desenli bir nöron konfigürasyonu bırakın. Lameli yerinde tutmak için ucu ve kuyunun sol alt köşesindeki cihazın kenarını sıkmak için cımbızı kullanın. Cihazı cımbızla yukarı kaldırarak lamel soyulması için hassas bir şekilde burulma uygulayın. Şekil 3c-3d'ye bakın.
- Her 2-3 günde bir, numune deneyler için kullanılana kadar NBM'nin yarısını değiştirin.
- Numune üzerinde yeniden kablolama deneyleri yapmadan önce, nöronal popülasyonları birbirine bağlayan filament olmadığından emin olmak için aralarındaki boşlukları mikroskopta inceleyerek tek popülasyon cihaz kanallarındaki nöritlerin ve çoklu popülasyon cihazındaki nöronal popülasyonların izole edildiğini doğrulayın.
5. PDL Kaplı Boncukların Hazırlanması
- Suda (1:500) seyreltilmiş 4, 10 veya 20 μm polistiren boncuklardan 2 x 50 μL'lik damla ila 1 mL PDL'ye (100 μg/mL) ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 saat bekletin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve ertesi gün devam ettirilebilir.
- Çözeltiyi 1 dakika boyunca 8.820 x g'da santrifüjleyin. Kabın dibinde biriken boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Boncukları 1 mL steril 10 mM HEPES pH 8.4 solüsyonu ile iki kez yıkayın.
- PDL kaplı boncukları 200 mL 10 mM HEPES pH 8.4 çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
6. Mikropipetlerin Hazırlanması
- Yatay bir elektrot çektirmesi kullanarak pipetleri cam kılcal borulardan (1 mm iç çap, 1,5 mm dış çap) hazırlayın. Çekilen mikropipetin dış ucu ~ 2-5 μm olacak şekilde ayarları yapın. Çekmeden önce cam tüplerin temiz olduğundan emin olun.
- Pipetleri saklamak için cam slaytlara sabitleyin ve uç kırılgan olduğu için ucun slaytın yüzeyine temas etmediğinden emin olun. Tozdan korumak için oda sıcaklığında kapalı bir kapta saklayın. Pipetleri çekildikleri gün kullanın.
>7. PDL-boncuk Nöronlara Yapışma
- 5. adımda hazırlanan 40-60 μL PDL kaplı boncukları, 4. adımda hazırlanan bir hücre kültürüne ekleyin. Pipet ucunu, lamel üzerinde belli belirsiz görünen nöronların üzerine ortalayın ve boncukları ekleyin (Bkz. Şekil 4).
- Sinaptik temasların oluşumunu teşvik etmek için numuneyi 1 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
- İnkübasyondan sonra, kültürü önceden ısıtılmış NBM ile nazikçe yıkayarak yapışmamış boncukları çıkarın.
>8. Fizyolojik Tuzlu Su Çözeltisinin Hazırlanması (Oda Sıcaklığı Deneyleri İçin)
- Fizyolojik bir tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Bu, inkübatörün dışındaki hücre ortamını düzenlemek içindir.
- Ozmolarite ve pH seviyelerini doğrulayın.
- Deneyler yaparken pH dalgalanmalarını en aza indirmek için çözeltiyi sürekli olarak O2 ile demleyin.
- Oda sıcaklığına ısıtın.
- Plastik bir tüpün (isteğe bağlı boyutlar) bir ucunu O2 ile aşılanmış bir fizyolojik çözeltiye sokarak ve diğer ucunu numune tutucuya yerleştirilen bir iğneye sabitleyerek perfüzyon sistemini kurun. Boruyu ve çözeltiyi s'den daha yükseğe yerleştirinample (Bkz. Şekil 5).
- Tüpü iğneden ayırın ve bir şırıngaya bağlayın. Tüpü doldurarak basınç uygulamak ve sıvı çekmek için şırıngayı kullanın. Bir silindir kelepçesi ile kapatın ve iğneyi yeniden bağlayın.
9. Boncuk mikromanipülasyonu
- Numuneyi, mikromanipülatörlere monte edilmiş iki mikropipet ile hücrelere yukarıdan erişilebilecek ve aşağıdan, örneğin ters çevrilmiş bir optik mikroskobun 40X fazlı objektifi (0,6'lık sayısal açıklık) ile optik olarak erişilebilecek şekilde bir deney düzeneğine yerleştirin. Bu konfigürasyonda, mikroskobun yan bağlantı noktasına görüntü yakalama için bir CCD kamera monte edin. Her pipeti plastik boru ile 1 mL'lik şırıngalara bağlayın. Bu adımda, NBM'yi fizyolojik bir tuzlu su çözeltisi (1-2 mL) ile değiştirin (Bkz. Şekil 5).
- Deneyler sırasında, hücreler 8. adımda hazırlanan fizyolojik salin solüsyonu ile 0.5-1 mL / dk oranında sürekli olarak perfüze edildi.
- Görüş alanındaki bir nörona bağlı OLMAYAN bir PDL boncuğu seçin. Boncuğa ve ardından mikropipete odaklanarak boncuğu bir mikropipet ucuyla hizalayın. Mikroskopta izleyerek ucu boncuğa mümkün olduğunca yaklaştırın.
- Boncuğu almak için pipete bağlı 1 mL şırınga ile negatif basınç uygulayın. Deney boyunca negatif basıncı koruyun.
10. Nöritleri Çekme
- Görüş alanındaki bir nörona bağlı bir PDL boncuğu seçin ve adım 9.3-9.4'te açıklandığı gibi emme kullanarak ikinci mikropipete takın.
- PDL-boncuk-nöron kompleksini yavaşça (~ 0.5 μm / dak) çekin, mikromanipülatörü veya numune aşamasını 1 μm hareket ettirin ve nörit başlangıcına izin vermek için 5 dakika duraklayın.
- Adım 10.2'yi iki kez tekrarlayın.
Not: Deneysel başarıyı garanti etmek için ilk 3 μm'nin çok yavaş çekilmesi gerekir, bu da zamanın% 95'inden fazlasında gerçekleşir.
- Mikromanipülatörü veya numune aşamasını 2 μm hareket ettirerek PDL-boncuk-nöron kompleksini yavaşça (~ 0,5 μm / dak) çekin ve nörit uzamasına izin vermek için 5 dakika bekleyin.
- Başarılı başlatma ve ilk 5 μm için nörit uzatmasından sonra, nöriti milimetre ölçeğinde mesafelerde 20 μm/dk'da çekin.
Not: Çekme işlemi sürekli veya kademeli olarak ve değişen oranlarda gerçekleştirilebilir. Şekil 6b-6c'ye bakın.
11. Nöronları Bağlama
- Nöritler açısından zengin bir bölge seçin ve PDL-boncuk-nörit kompleksini fiziksel olarak temas edecek şekilde indirin. Lamel yüzeyinin üzerindeki uç yüksekliğini ölçmek için diğer boncukları kullanın. Şekil 6d'ye bakın.
- İkinci mikropipeti manipüle ederken PDL-boncuk-nörit kompleksini hedef nörit ile temas halinde bırakın. İkinci pipeti, ikinci PDL boncuğu ile yeni oluşturulan nöritin üzerine, ilk boncuktan yaklaşık 20 μm uzağa indirin. Yeni nörit filamentini hedef hücreye doğru itmek için ikinci PDL boncuğunu kullanın.
- Her iki boncuğu da en az 1 saat yerinde tutun. Mikroskopla boncukla temas eden nöritlerin kalınlaşması olan fokal şişmenin olmadığını doğrulayın16.
- Bu süre zarfında, numunenin ortamını fizyolojik tuzlu sudan önceden ısıtılmış, CO2 ile dengelenmiş NBM'ye yavaşça değiştirmek için perfüzyon kullanın.
- Emmeyi serbest bırakarak boncuğu ikinci pipetten serbest bırakın. Yeni nörit takılı kalırsa, ilk boncuğu da serbest bırakın. Şekil 6e'ye bakın.
- Salin solüsyonunu nazikçe çıkarın ve NBM (~ 2 mL) ile değiştirin.
- Gelecekteki deneyler için nöronal bağlantıyı güçlendirmek için numuneyi dikkatlice inkübatöre geri yerleştirin. Bu bağlantı >24 için kararlıdır
