İnsan Dermal Fibroblast Hücrelerini Yeniden Programlayarak Nöronlar Üretmek

Özet

Kaynak: Shrigley, S., et al. İnsan Yetişkin Cilt Fibroblastlarından İndüklenmiş Nöronların Yüksek Verimli Kültürünün Basit Üretimi. J. Vis. Uzm. (2018)

Video, yetişkin insan dermal fibroblastlarından (aHDF'ler) nöron oluşumunu göstermektedir. AHHDF'ler, nöronal transkripsiyon faktörleri ve kısa firkete RNA'ları (shRNA'lar) için genler taşıyan bir lentiviral vektör kullanılarak yeniden programlanır. ShRNA'lar, bir nöronal transkripsiyonel baskılayıcının ekspresyonunu inhibe eder ve nöronal transkripsiyon faktörleri, aHDF'leri nöronlara farklılaştırmak için genleri aktive eder. Bu yeniden programlanmış aHDF'ler, olgun nöronlar oluşturmak için erken ve geç bir nöronal dönüşüm ortamında kültürlenir.

Protokol

1. Yeniden Programlama için Cilt Fibroblastlarının Hazırlanması

1. Otomatik bir hücre çözme sistemi veya 37 ° C'lik bir su banyosu kullanarak, yetişkin insan dermal fibroblastlarını (aHDF'ler) ve plakayı T75 şişesi başına 200.000 (otomatik hücre sayacı ile sayın) 10 mL fibroblast ortamında (bkz. Tablo 1) 37 ° C'de% 5 CO₂.
2. Ertesi gün fibroblast besiyeri ile tam bir besiyeri değişimi gerçekleştirin.
3. 
   

3. 
   
5. 
   

Sonuçlar

Şekil 1: iN dönüşümünün zaman içindeki evrimi.(A) Deneyin zaman çizelgesi ve yetişkin insan dermal fibroblastlarını yeniden programlamak için kullanılan bir lentivirüs içinde paketlenmiş yapının haritası. Her siyah ok, orta düzeyde bir değişikliği temsil eder. (B) 0. gün ile 22. gün arasındaki dönüşüm süreci sırasında hücrelerin morfolojisindeki değişiklikleri göstere...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre Hatları
Erişkin insan dermal fibroblastları			[C2 pasaj #7] Donör 67 yaşında bir kadındı. John van Geest Beyin Onarım Merkezi'ndeki (Cambridge, İngiltere) Parkinson Hastalığı Araştırma ve Huntington hastalığı kliniklerinden elde edilen hücreler.
Fibroblast Kültürü, Transdüksiyon ve Konversiyon için Reaktifler
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco (Gibco)	14190094
Tripsin-EDTA [% 0.5]	Gibco (Gibco)	15400-054	DPBS'de% 0.05'e seyreltin.
Virkon (virüsü nötralize etmek için kullanılan ajan)	Viroderm Belediyesi	7511	Ilık suyla% 1'lik çözeltiye seyreltin.
Milli-Q Su	Kırlangıç
Bazal ortam - Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) + GlutaMax	Gibco (Gibco)	61965059
Penisilin / Streptomisin [10.000 U / mL]	Gibco (Gibco)	15140-122
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Gibco (Gibco)	10270-106
CryoMACS® dimetil sülfoksit (DMSO) 10	Miltenyi	170-076-303
Nöral farklılaşma ortamı - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002 Serisi
LM-22A4	Tocris (Türkçe)	4607	1450 μL DMSO. içinde 10 mg seyreltin Stok konsantrasyonu: 20 mM.
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) [rekombinant insan]	Ar-Ge sistemleri	212-GD-010	DPBS'de 10 ug'yi 500 μL% 0,1 BSA'da seyreltin. Stok konsantrasyonu: 20 μg/mL.
NT3 [rekombinant insan]	Ar-Ge sistemleri	267-N3-025	DPBS'de 25 mL'de 2,5 μg %0,1 BSA ile seyreltin. Stok konsantrasyonu: 10 μg/mL.
db-cAMP	Sigma Aldrich	D0627	1 g'ı 40,7 mL Milli-Q su ile seyreltin. Süzün ve 500 μL'lik alikotlar veya 10 mL'lik stok tüpleri yapın. Stok konsantrasyonu: 50 mM.
CHIR99021	akson	1386	2 μg'yi 429,8 μL DMSO. içinde seyreltin Stok konsantrasyonu: 10 mM.
LDN-193189	akson	1509	2 mg'ı 360 μL DMSO. içinde seyreltin Stok konsantrasyonu: 10 mM.
Valproik asit sodyum tuzu (VPA)	Merck Kırlangıç	676380	1 M'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için 5 g Milli-Q su ile seyreltin. DİKKAT: Yutulmasından, cilt ile temasından ve toz oluşumunu solumaktan kaçının.
Kaplamalar için Reaktifler
jelatin	Sigma Aldrich	G2500	Milli-Q suda% 0.1'e seyreltin.
Poli-L-ornitin	Sigma Aldrich	P3655 Serisi	Milli-Q suda çözülür. 15μg / mL'de kullanın.
Fibronektin	ThermoFisher Bilimsel	33010-018	2 mL Milli-Q su + 70 μL 0,25 M NaOH. 5 μg/mL'de kullanın.
Laminin	ThermoFisher Bilimsel	23017-015	-80 ° C'de saklayın. Buz üzerinde çözdürün, serin tutun ve 30 μL'de alikot edin. 5 μg / mL'de kullanın.
ekipman
T75 şişesi [Nunclon Delta Yüzeyi]	ThermoFisher Bilimsel	156499
24 kuyulu plaka [Nunc]	ThermoFisher Bilimsel	142485
1,5 mL polipropilen tüp	Sigma Aldrich	Z336769
15 mL şahin tüpü	Sarstedt	6,25,54,502
50 mL şahin tüpü	Sarstedt	6,25,47,254
Pippette denetleyicisi			1-25 mL pipetleme hacimleri için.
Steril serolojik pipetler: 5, 10 ve 25 mL	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Ayarlanabilir hacimli pipetleyiciler: 5, 20, 200 ve 1.000 μL
Steril pipet uçları			0,5 - 1.000 μL'lik pipetleme hacimleri için.
ThawSTAR Otomatik Hücre Çözme Sistemi	BiyoKesim	BCS-601
Kontes II Otomatik Hücre Sayacı	ThermoFisher Bilimsel	AMQAX1000
Hücre sayma odaları [50 slayt] ve tripan mavisi [% 0.4]	ThermoFisher Bilimsel	C10228	Kontes II Otomatik Hücre Sayacı ile kullanım için.
Laminer akış başlığı
Nemlendirilmiş %5 CO2 37 °C inkübatör
merkezkaç			1,5, 15 ve 50 mL'lik tüpler için uygundur.
Yörünge çalkalayıcı
Ters floresan mikroskobu	Leica Belediyesi	DMI6000 B

Sayılı Kanun Hükmünde Kararname Teknolojisi Serisi Adet · Serisi Serisi · Serisi · · Belediyesi Belediyesi Belediyesi Serisi Serisi