Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Ön Dilimleme Hazırlığı
- Planlanan tümör rezeksiyonu ve doku alımından bir gün önce "doku işleme" ortamı ve "dilim kültürü bakım" ortamı hazırlayın (veya 2 hafta içinde önceden oluşturulmuş ortamı kullanın). 5 mL Penisilin-Streptomisin çözeltisi (10.000 U/mL) ve 5 mL 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) 500 mL Yüksek Glikozlu Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamına (DMEM) ekleyin doku işleme ortamını oluşturmak için.
- Fenol kırmızısı içermeyen bir nöronal ortam tabanı (örneğin, Nörobazal) kullanarak 250 mL dilim kültürü bakım ortamı hazırlayın. Bu ortamı 10 mM HEPES, 1x B-27 takviyesi, 400 μM L-glutamin, 600 μM L-alanil-L-glutamin dipeptid, 60 U/mL penisilin, 60 μg/mL streptomisin ve 6 U/mL nistatin ile destekleyin.
- Tüm ortamları en fazla 2 hafta boyunca 4 °C'de saklayın.
2. Ameliyat Günü: Doku Kazanımı
- Doku edinimi gününde, otoklavlanmış cam eşyalar ve laminer akış başlığında steril teknik kullanarak doku işleme ortamında 50 - 100 mL %1 ve %2 (ağırlıkça/hacimce%) düşük erime sıcaklıklı agaroz çözeltileri hazırlayın. Tümör dokusu kıvamındaki öngörülemeyen varyasyonu karşılamak için her iki agaroz konsantrasyonuna da ihtiyaç vardır.
- Agaroz süspansiyonunu bir mikrodalga kullanarak hafifçe kaynama gözlenene kadar ısıtın. Kullanıma kadar sıvı halde tutmak için agaroz solüsyonunu 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL dilim kültürü bakım ortamı yerleştirin.
- Her oyuğa boş politetrafloroetilen (PTFE) kültür ekleri yerleştirmek için steril bir forseps kullanın. Plakayı, 37 ° C'de tutulan% 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş, su ceketli bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Laminer akış başlığında steril bir Pasteur pipeti kullanarak, tümör dokusu ediniminden önce yaklaşık 15 ila 30 dakika boyunca buz gibi soğuk doku işleme ortamı içeren bir şişeye %95 O2/5 CO2 gazı karışımını köpürtün. Supra-oksijenlenmiş ortamın kullanılması, işleme sırasında toplu dokudaki hipoksiyi en aza indirir.
- Ameliyathane ve dilimleme tesisi arasında doku taşımak için 20 mL supra oksijenli buz gibi soğuk işleme ortamı içeren etiketli 50 mL konik tüpler (izole edilecek istenen sayıda bireysel tümör bölgesi için yeterli) hazırlayın.
- Bir beyin cerrahı ile birlikte, örnek alımı için tümör bölgesini ameliyat öncesi planlayın. Hastanın klinik görüntülemesinde gösterildiği gibi kontrast tutulumu olan bir tümör bölgesi seçin (T1 gadolinyum sonrası manyetik rezonans görüntüleme (MRI) dizileri). Önceki deneyimler, bu alanın nekrotik dokunun aksine canlı tümör dokusu verdiğini göstermektedir.
not: Çevredeki (peritümöral) beyaz maddeden dilimler oluşturulmaya çalışıldı; Bununla birlikte, arka plan otofloresansı ve azalmış tümör hücresi yoğunluğu, bu dilimlerin deneysel faydasını sınırladı.
- Tümör rezeksiyonunun başlangıcına doğru tümör dokusu elde edin. Termal yaralanmaya ikincil doku canlılığını tehlikeye atabilecek geniş bipolar koterlere maruz kalan tümör dokusunun toplanmasından kaçının. Parçalı tümör rezeksiyonu sırasında elde edilen doku örnekleri, uzun en blok rezeksiyonlardan elde edilen dokularla karşılaştırıldığında daha iyi canlılık gösterir. Bu gözlem, cerrahi rezeksiyonun bir sonucu olarak diferansiyel tümör dokusunun kan akışından yoksun kalması ve edinim süresinin uzaması ile ilgili olabilir.
- İstenirse, farklı tümör bölgelerinden örnekleri izole etmek için tümör dokusunu ayrı konik tüplerde etiketleyin ve saklayın. (ör. yüzeysel ve derin tümör dokusu). İntraoperatif cerrahi navigasyon mevcutsa/mevcut olduğunda kesin doku konumları kaydedilebilir.
3. Dilim Kültürü Hazırlama
- Tümör dokusu parçalarını buz gibi soğuk işleme ortamı olan bir Petri kabına yerleştirin. Tümör dokusunu yıkamak ve yapışan kırmızı kan hücrelerini en aza indirmek için, petri kabındaki ortamı üç kez nazikçe değiştirmek ve atmak için bir pipet kullanın.
- Bir neşter kullanarak, tümör parçalarını dikdörtgen kutu şekillerinde kesin. Doku parçalarını yaklaşık 3 mm x 3 mm x 10 mm olacak şekilde kesin. Bağlı damarları eksizyon veya ince forseps ile hafif çekiş yoluyla dikkatlice çıkarın.
- 5 - 7 mL 37 °C agarozu küçük küp şeklinde (~ 2cm3) plastik bir gömme kalıbına pipetleyin. Kullanmadan önce agaroz çözeltisinin sıcaklığının steril bir termometre ile 37 ° C'den yüksek olmadığını onaylayın.
- Agarozun bir buz yatağında yaklaşık 1 dakika oturmasına izin verin.
- 2 - 4 tümör dokusu "şeritlerini" uzun ekseni dikey olarak yönlendirilmiş agaroz içine yerleştirin. not: Doku şeritleri, katılaşmadan önce agarozda "batma" eğiliminde olacaktır. Bu komplikasyonu önlemek için, agaroz daha fazla katılaşana kadar doku şeridini geçici olarak dikey yönde tutun.
- Katılaşmayı kolaylaştırmak için agaroz küfü içeren dokuyu 2-5 dakika buz yatağında tutun.
- Küfü buzdan çıkarın ve kalıbın kenarlarını bir neşter ile keserek agaroz bloğunu nazikçe çıkarın. Bloğa aşırı kuvvet uygulamaktan kaçının, bu agarozu kırabilir.
- Agaroz bloğunu vibratom numune plakasına sabitlemek için bol miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın. Tutkalın yaklaşık 1-2 dakika sertleşmesine izin verin.
- Numune plakasına yapıştırılmış agaroz bloğunu daldırmak için vibratom haznesini buz gibi soğuk işleme ortamıyla doldurun.
- Dilimleme sırasında, %95 O2 /% 5 CO2 gaz karışımını, kesilmiş steril bir plastik pipet aracılığıyla vibratom haznesine kabarcıklayın.
- Vibratom dilim kalınlığını 300 - 350 μm olarak ayarlayın.
- Doku kıvamına göre bıçak ilerleme hızını ve bıçak genliğini ayarlayın. "Daha sert" glioblastoma dokusu, daha yavaş bıçak ilerleme hızları ve daha yüksek genlik gerektirir. Tam bıçak hızı ve genlik ayarları, vibratom özelliklerine göre değişecektir.
not: Dilimleme sırasında genellikle çeşitli sorunlar ortaya çıkar. Doku şeridi agaroz bloğundan çıkarsa, dokuyu daha yüksek konsantrasyonda bir agaroza gömmeyi deneyin. Tümör dilimleri istenenden daha kalınsa (makine seti) veya asimetrikse, vibratom bıçağının genliğini artırın ve hızını azaltın. Dilimleme meydana gelirken tümör dokusunun bıçak tutucusuna yapışmamasını veya bıçak tutucu tarafından "sürüklenmemesini" sağlamak için, bıçak hareket ettikçe mikrospatulayı bıçak tutucu ile dilim arasına dikkatlice yerleştirin.
- Doku dilimlerini paslanmaz çelik bir mikrospatula kullanarak buz gibi soğuk işleme ortamıyla Petri kabına aktarın.
- İnkübatörden PTFE ekleri ve dengelenmiş dilim kültür ortamı içeren 6 oyuklu plakalar elde edin (bölüm 2, adım 4'te hazırlandığı gibi).
- Paslanmaz çelik bir mikrospatula kullanarak plaka doku dilimleri. Dilimi spatuladan nazikçe itmek ve kültür ekinin üzerine itmek için bir "sıvı dalgası" oluşturmak üzere küçük, ince kıllı bir boya fırçası kullanarak dokunun doğrudan temasını ve manipülasyonunu en aza indirin.
not: Doku kültürü ekinin üzerine eklenen işleme ortamı miktarını en aza indirin. Dilimlerin yüzmesine neden olan aşırı miktarda ortam aktarılırsa, ortamı çıkarmak için steril bir Pasteur pipeti kullanın.
- Tümör dilimleri içeren 6 oyuklu plakaları,% 5 CO2 atmosferi ile 37 ° C'de tutulan bir inkübatöre geri koyun.
not: Tüm gömme ve dilimleme protokolü, ameliyathaneden tümör dokusu alındıktan sonraki 90 dakika içinde tamamlanmalıdır.
4. Dilim Kültürü Bakımı
- 12 - 24 saat sonra, her bir kesici uç kenarını steril bir forseps ile kavrayarak dilim kültürlerini aktarın ve taze dilim kültürü bakım ortamı içeren plakalara aktarın. Ekleri aktarmadan önce her bir oyuğa alınan dilim kültürü bakım ortamının inkübatörde en az 15 dakika dengelendiğinden emin olun.
- Kesici uçları, her 48 saatte bir taze dengelenmiş dilim kültür ortamı ile yeni 6 oyuklu plakalara taşıyın.
- İstenirse, biyokimyasal tahlillerde hemen kullanım için eski dilim kültür ortamını bir pipetle ayırın veya ileride kullanmak üzere -80 °C'de dondurun.
