İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Hücre Kültürü Modelinin Geliştirilmesi

Özet

Kaynak: Fattakhov, N., et al. İn vitro iskemik inmeyi incelemek için insan kan-beyin bariyerinin üçlü birincil hücre kültürü modeli. J. Vis. Uzm.(2022)

Bu video, insan beyni perisit, astrosit ve endotel hücrelerinin birlikte kültürlenmesini göstermektedir. Her hücre katmanı ayrı ayrı oluşturulur ve daha sonra birlikte kültürlenir, böylece kan-beyin bariyerinin hücresel düzenlemesini taklit eden üç katmanlı bir sistem oluşturulur

Protokol

1. Üçlü hücre kültürü BBB modeli ayarı

1. Tohumlama perisitleri
   1. HBVP'yi (İnsan beyni vasküler perisitleri), birleşene kadar 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörü içinde hücre yapışması için aktive edilmiş bir yüzeye sahip T75 kültür şişelerinde yetiştirin. Birleşmeye ulaşıldığında, eski perisit ortamını aspire edin ve hücreleri 5 mL ılık Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve 4 mL ılık tripsin-EDTA çözeltisi ve 1 mL DPBS'nin bir kombinasyonunu kullanarak hücreleri şişeden ayırın.
      NOT: P7'den sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.
   2. Şişeyi bir CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hücrelerin şişeden ayrılıp ayrılmadığını doğrulamak için mikroskop altında görüntüleyin. Şişeye 5 mL ılık perisit ortamı (% 2 fetal sığır serumu [FBS] içeren) ekleyin ve ayrılan hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   3. Hücre süspansiyonunu 200 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve hücrelerin tüpün dibinde bir pelet oluşturmasına izin verin. Ortamı tüpten aspire edin, hücre peletinin sağlam kaldığından emin olun.
   4. Hücre peletini perisit ortamında yeniden süspanse edin; hücrelerin birleşmesine ve ihtiyaç duyulan iyi yerleştirme sayısına bağlı olarak ortam miktarını hesaplayın. Yeniden askıya alınan hücrelerin 10 μL'sini alın, bunları bir hücre sayma slaydına yerleştirin ve hücre sayısını sayın.
   5. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve 300.000 hücreyi tohumlayın / 1 mL perisit ortamında kuyu eklerinin abluminal tarafına yerleştirin (6 oyuklu format).
      not: HBVP'yi kesici uçların alt tarafına ekerken, iyi yerleştirilmiş plakaları ters çevirmek önemlidir. Plaka bir yüzeye düz bir şekilde yerleştirilirken, kuyu eklerinin abluminal tarafını ortaya çıkarmak için alt kısmı çıkarın. Buharlaşmayı önlemek için abluminal tarafa perisit hücre süspansiyonu ekledikten sonra kuyu eklerini ters çevrilmiş plaka ile örtün. Tüm plakaları gece boyunca 37 °C'de% 5 CO₂ inkübatörde ters çevirin.
2. Astrositlerin tohumlanması
   1. HA'yı (İnsan astrositleri) T75 şişelerinde %5'lik bir CO₂ inkübatörü içinde 37 ° C'de birleşmeye ulaşılana kadar yetiştirin. Perisit ortamı yerine astrosit ortamı (ayrıca% 2 FBS içerir) kullanarak yukarıdaki 1.1.1-1.1.4 adımlarını izleyin.
      NOT: P9'dan sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.
   2. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve 300.000 hücre/kuyu doku kültürü 6 oyuklu plakaların dibine tohumlayın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı örtün ve tüm plakaları gece boyunca 37 °C'de %5_CO2 inkübatörde tutun.
3. Endotel hücrelerinin tohumlanması
   1. HBMEC'yi (İnsan beyni mikrovasküler endotel hücreleri), birleşene kadar 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörü içinde doku kültürü kaplarında yetiştirin. Yukarıdaki adımları izleyin 1.1.1-1.1.4 perisit ortamı yerine tam bir klasik ortam (%10 FBS içeren) kullanarak.
      not: P12'den sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.
   2. 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörden astrositler içeren doku kültürü 6 oyuklu plakaları ve perisitleri içeren kuyucuklu ekleri (6 oyuklu format) çıkarın. Astrosit ortamını doku kültürü 6 oyuklu plakalardan aspire edin. Her oyuğa 1 mL perisit ortamı ve 1 mL astrosit ortamı ekleyin.
   3. Perisit ortamını kuyucuk eklerinden aspire edin ve tohumlanmış astrositleri içeren doku kültürü 6 oyuklu plakalara yerleştirin. 300.000 hücre/kuyu yoğunluğunda HBMEC'yi 2 mL tam klasik besiyerinde aynı kuyu ekinin apikal tarafına tohumlayın.
      not: Endotel hücreleri, kuyu eklerinin abluminal tarafındaki perisitler ve doku kültürü 6 oyuklu plakalar üzerindeki astrositler tohumlandıktan sonraki gün kuyu eklerinin apikal tarafına tohumlanmalıdır. Hücreler, BBB benzeri özellikleri indüklemek için altı gün boyunca üçlü kültürde tutulmalıdır. Hücre kültürü ortamı, deneylerden 24 saat önce her iki iyi yerleştirilmiş bölmede değiştirilmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24 mm Transwell, 0,4 μm Gözenekli Polyester Membran Insert ile	Corning	3450
35 mm Cam Tabanlı Tabaklar	MatTek Yaşam Bilimleri (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrosit Ortamı	Bilim Hücresi	1801
Bağlanma Faktörü	Hücre Sistemleri (Fisher Scientific)	4Z0-201
Serum ve CultureBoost ile Komple Klasik Ortam	4Z0-500	Hücre Sistemleri
Corning 50 mL PP Santrifüj Tüpleri (CentriStar Kapaklı Konik Tabanlı	VWR (VWR)	430829
Corning 75cm² U-Şekilli Eğimli Boyun İşlem Görmemiş Hücre Kültürü Şişesi	Corning	431464U
Corning CellBIND 96 kuyulu Düz Şeffaf Alt Siyah Polistiren Mikroplakalar	Corning	3340
Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları	Thermo Fisher Bilimsel	C10228
Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı	Thermo Fisher Bilimsel	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM Ortamı (Glikoz yok, glutamin yok, fenol kırmızısı yok)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	A14430-01	Glikoz içermeyen ortam
DPBS (Kalsiyum Yok, Magnezyum Yok)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	14190250
EBM Endotel Hücre Büyümesi Bazal Ortam, Fenol Kırmızı İçermez, 500 mL	Fransa	CC-3129
CO2 inkübatörü
merkezkaç