$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Jelatin metakriloyl (GelMA) sentezi
- Domuz derisinden elde edilen 10 g jelatini tartın ve çözeltinin tamamen çözünene kadar 240 rpm ve 50 ° C'de bir ısıtma plakası üzerinde karıştırılmasına izin vererek 100 mL PBS'de çözün
.
- Bir kaputun altına, düşük derecede işlevselleştirme için 2 mL metakrilik anhidrit (MA) ekleyin ve jelatin emülsiyonunun 2 h.
için 240 rpm ve 50 °C'de karışmasına izin verin
Dikkat: MA tehlike bildirimi: H302 + H332 (yutulduğunda veya solunduğunda zararlı), H311 (cilt ile temasında toksik), 314 (ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur), 315 (cilt tahrişine neden olur), H317 (alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir), H318 (ciddi göz hasarına neden olur), 331 (solunduğunda toksik), H332 (solunduğunda zararlı), H335 (solunum yolu tahrişine neden olabilir). Kullanım yönergeleri: P261 (toz/duman/gaz/sis/buhar/sprey solumaktan kaçının), P305 + P351 + P338 + P310 (GÖZ İLE TEMASI HALİNDE: Su ile birkaç dakika dikkatlice durulayın. Varsa ve yapılması kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Durulamaya devam edin. Derhal bir ZEHİR MERKEZİ/doktoru arayın), P301 + P312 + P330 (YUTULMASI HALİNDE: Kendinizi iyi hissetmiyorsanız bir ZEHİR MERKEZİ/doktoru arayın. Ağzınızı çalkalayın).
not: MA'yı çok yavaş, damla damla ekleyin.
- 200 mL nihai hacim elde etmek için jelatin-MA çözeltisini 100 mL önceden ısıtılmış PBS (50 °C) içinde seyreltin ve çözeltinin 240 rpm ve 50 °C'de 10 dakika karışmasına izin verin.
- Diyaliz membranından ~20 cm kesin (moleküler kesim 12-14 kDa) ve yumuşayana kadar deiyonize suya batırın.
not: Delik veya kusur olmadığından emin olmak için membranları deiyonize su ile doldurun.
- Bir huni kullanarak jelatin-MA çözeltisini membranlara aktarın.
not: Karışıma izin vermek için her iki tarafı da içeride fazladan boşluk bırakarak kapatın.
- Jelatin-MA solüsyonunu içeren membranları diyaliz için 2 L distile su içeren bir kaba koyun ve 5 gün (500 rpm) boyunca 40 °C'de karıştırmalarına izin verin.
not: Suyun buharlaşmasını önlemek için kabı örtün.
- Damıtılmış suyu günde iki kez değiştirin. Her seferinde homojenizasyon için membranları ters çevirin.
- Beşinci günde, 200 mL önceden ısıtılmış ultra saf suyu (40 °C) diyaliz jelatin-MA ile karıştırın ve 40 °C'de 15 dakika karıştırın.
- Jelatin-MA solüsyonunu 25 mL'ye kadar 50 mL konik tüplere aktarın ve tüplerin 2 gün boyunca -80 °C'de kalmasına izin verin.
not: Liyofilizasyonu kolaylaştırmak için tüpleri yatay olarak saklayın.
- Donmuş çözeltileri 3-5 gün boyunca liyofilize edin ve liyofilize GelMA'yı nemden koruyarak saklayın.
2. Bioink hazırlama
NOT: 1 mL biyomürekkep elde etmek için, filtrasyon sırasında kayıplar olabileceğinden en az 3 mL biyomateryal çözeltisi üretilmesi önerilir.
- Fibrinojen çözeltisinin hazırlanması
- Deiyonize suda tuzlu su çözeltisi (NaCl% 0.9) hazırlayın ve 10 mg / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için sığır plazmasından 1 mg fibrinojeni 1 mL tuzlu su çözeltisinde çözün.
not: Fibrinojen cama adsorbe olduğundan, fibrinojen çözeltisini hazırlamak için cam şişeler kullanmayın.
- Fibrinojenin tamamen çözünmesine kadar çözeltiyi 37 ° C'de çalkalayın.
NOT: Fibrinojen çözünmesi için, 37 °C'de bir fırının içine yerleştirilmiş bir döner sistem kullanın. Fibrinojenin 37 °C'de sıcak bir plaka üzerinde manyetik çalkalanması (180 rpm) da uygundur. Bu koşul altında, 10 mg / mL fibrinojenin çözünmesi yaklaşık 40 dakika sürer.
- Jelatin/GelMA çözeltisinin hazırlanması
- 0.12 g jelatini tartın ve %4 (a/h) jelatinlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1.9 mL önceden ısıtılmış PBS'ye (40 °C) ekleyin. Çözünmeyi kolaylaştırmak için girdap.
- Emülsiyonu tamamen çözünene kadar 40 ° C'de tutun.
- 0.06 g liyofilize GelMA'yı tartın ve %2 (a/a) GelMA'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için jelatin çözeltisine aktarın. Çözünmeyi kolaylaştırmak için girdap.
- Çözeltiyi tamamen çözünene kadar 40 ° C'de tutun.
3. Astrosit yüklü jelatin/GelMA/fibrinojen biyomürekkebinin hazırlanması
- 10 mg / mL fibrinojen çözeltisinin 0.9 mL'sini pipetleyin ve 3 mg / mL fibrinojen nihai konsantrasyonu elde etmek için jelatin / GelMA çözeltisine aktarın.
- 0.015 g foto başlatıcı (PI) tartın ve% 0.5 (a / h) PI'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için jelatin / GelMA / fibrinojen çözeltisine aktarın. Tüpü yukarı ve aşağı çevirerek çözeltiyi karıştırın ve PI bozulmasını önlemek için ışıktan koruyarak 40 ° C'de tutun.
not: Biyomürekkebi 4 °C'de maksimum 24 saat stoklayın.
- Laminer akış altında, çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak steril 15 mL'lik bir konik tüpe süzün.
not: Filtrasyona izin vermek için biyomateryal çözeltisi 37-40 ° C'de olmalıdır.
- 980 μL biyomateryal çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- 100 μg / mL'lik bir stok çözeltisi elde etmek için laminini tuzlu su çözeltisi içinde seyreltin.
- 20 μL laminin pipetleyin ve 2 μg/mL lamininlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için biyomürekkebi içeren tüpe aktarın.
- Kabarcıkları önleyerek yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Herhangi bir kabarcık devam ederse, konik tüpü 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Bioink'i hücrelerle karışana kadar 37 °C'de tutun.
- Primer astrositleri 5 dk.
% 0.05 tripsin ile tripsine edin
not: 1'den 3'e kadar olan pasajlardan astrositleri kullanın.
- Tripsin aktivitesini FBS ile 1: 1 oranında nötralize edin ve hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri sayın ve 1 x 106 hücreyi farklı bir konik tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Konik tüpün altına hafifçe vurarak hücre peletini askıya almak için küçük bir hacim (~ 200 μL) bırakarak süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri içeren tüpe 1 mL jelatin/GelMA/fibrinojen çözeltisi aktarın ve homojenize etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, 1 x 106 hücre/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde edin.
3. Çapraz bağlayıcı çözeltisinin hazırlanması
- Trombin sulandırması
- 15 mL'lik konik bir tüpte% 0.1 (a/h) sığır serum albümini (BSA) ile steril deiyonize suda 100 U / mL'lik bir trombin stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C.
'de mikrotüplerde stok yapın
NOT: Trombin cama adsorbe olduğundan, stok çözeltisini hazırlamak veya alikotları saklamak için cam şişeler kullanmayın.
- Trombin-CaCl2 çözeltisinin hazırlanması
- 100 μL trombin stok solüsyonunu pipetleyin ve 1 U/mL trombin nihai konsantrasyonu elde etmek için 8.9 mL steril deiyonize su içeren 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Deiyonize suda %10 (a/a) CaCl2 çözeltisi hazırlayın ve 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.
% - 10'luk CaCl2 çözeltisinin 1.1 mL'sini, 1: 9'luk bir nihai oran elde etmek için trombin içeren konik tüpe aktarın (CaCl2'ye trombina).
not: Depolamadan kaçınarak deney için hacimde çapraz bağlayıcı çözeltisini hazırlayın.
4. Ekstrüzyon tabanlı bir biyoyazıcı kullanarak astrosit yüklü biyomürekkebin biyo baskısı
- Nöral dokunun tasarımı
- G kodunu kullanarak: X ve Y eksenindeki her biyo-baskılı çizgi arasında 1 mm mesafe ve Z ekseninde 6 katman (her çizgi arasında 0,2 mm) olan 6 x 6 mm'lik (kare şeklinde) bir ızgara oluşturun; ekstrüzyonu (E) 0,01 mm'ye ayarlayın, Z ekseninin her yeni katmanında 0,001 mm artırın; ve baskı hızını (F) 400 mm/dak olarak ayarlayın (Ek Bilgiler).
- Biyoyazıcı kurulumu
- Makineyi 15 dakika UV ışığına maruz bırakın ve ardından %70 etanol ile silin.
- Güç düğmesini kullanarak biyoyazıcıyı açın. Makineyi bir USB kablosuyla bilgisayara bağlayın. Biyoyazıcıya bağlamak için kontrol yazılımını açın ve dosya tasarımını yükleyin.
- Biyo-baskı şırıngasının hazırlanması
- Astrosit yüklü jelatin/GelMA/fibrinojen biyomürekkebini 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 5 mL'lik plastik bir şırıngaya aktarın.
not: Kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça aktarın.
- Şırıngaya 22 G künt steril bir iğne bağlayın.
not: Şırıngayı 4 °C'de 2 dakika bekletin.
- Şırıngayı biyoyazıcı yazıcı kafasına bağlayın ve kalan kabarcıkları çıkarmak için biyomürekkebi manuel olarak yıkayın.
- Biyobaskı
NOT: Biyobaskı, laminer başlığın dışında gerçekleştirilmiştir.
- Biyoyazıcı tablasına 35 mm'lik bir kültür kabı yerleştirin ve iğne hareketine izin vermek için iğneyi kültür kabı yüzeyinden 0.1 mm uzağa yerleştirin.
NOT: Her biyobaskı için bir adet 35 mm kültür kabı kullanın.
- Yazdır düğmesine basın.
- Biyo-baskı bittiğinde, şırınganın tabaktan uzaklaştığından emin olun. Ardından, kültür kabını kapatın ve çapraz bağlama işlemine hazırlanın.
not: Bir yapının biyobaskısı yaklaşık 1 dakika 10 saniye sürer.
- Biyo-baskılı yapı ve kültürün çapraz bağlanması
- GelMA çapraz bağlama için kültür kabını 2 x 60 s (yukarı ve aşağı) boyunca 2 mW/cm2'de UV ışığı altına yerleştirin.
- Laminer akış altında, biyobaskılı yapıyı steril bir spatula kullanarak 24 oyuklu bir plakaya aktarın.
- 500 μL trombin / CaCl2 çözeltisi ekleyin ve fibrin çapraz bağlanmasına izin vermek için 30 dakika bekletin.
- Çapraz bağlama solüsyonunu çıkarın ve yapıyı 2 mL PBS 1x ile yıkayın. Ardından, PBS'yi 1 mL astrosit kültür ortamı ile değiştirin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ortamı her 3 günde bir değiştirin.