Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hyaluronik Asidin Tiyolasyonu
>NOT: Molar oranlar, aksi belirtilmedikçe toplam karboksilat grubu sayısına göre belirtilmiştir.
- 500 mg sodyum hyaluronatı (HA, 500-750 kDa) 10 mg / mL'de deiyonize edilmiş, damıtılmış suda (DiH2O) otoklavda sterilize edilmiş 250 mL Erlenmeyer şişesinde çözün. HA'yı tamamen çözmek için çözeltiyi (~ 200 rpm) oda sıcaklığında 2 saat karıştırın. Tiyolasyon prosedürü sırasında reaksiyonun karışmasını sağlamak için bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanın.
- 0.1 M hidroklorik asit (HCl) kullanarak, HA çözeltisinin pH'ını 5.5'e ayarlayın. 69.6 mg (0.25x molar oran) 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) tartın.
not: Çözünmemiş EDC doğrudan HA çözeltisine eklenebilse de, EDC'yi önce 1 mL DiH2O'da çözmek ve daha sonra EDC çözeltisini HA çözeltisine hızlı bir şekilde eklemek tipik olarak daha kolaydır. 1 mL DiH2O'da ön çözünme, adım 1.3 ve 1.4'te reaksiyona eklenmeden önce N-hidroksisüksinamid (NHS) ve sitamin dihidrokolorid ile de yapılabilir.
- Reaksiyona 17.9 mg (0.125x molar oran) NHS ekleyin. Reaksiyon çözeltisinin pH'ını 0.1 M HCl kullanarak 5.5'e ayarlayın ve reaksiyonu oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
- Reaksiyon çözeltisine 70.0 mg (0.25x molar oran) sitamin dihidroklorür ekleyin. PH'ı 6,25'e ayarlamak için 0,1 M sodyum hidroksit (NaOH) kullanın. Karıştırırken reaksiyonu gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Ertesi gün, reaksiyon çözeltisinin pH'ını yaklaşık 8'e ayarlamak için 1 M NaOH kullanın. Reaksiyona 192 mg (4x molar oran) ditiyotreitol (DTT) ekleyin. DTT ilavesinden sonra pH'ı tekrar 8'e ayarlayın ve oda sıcaklığında 1-2 saat karıştırmaya bırakın.
- PH'ı 4'e ayarlamak için 1 M HCl kullanın. Tüm reaksiyon karışımını önceden ıslatılmış bir diyaliz membranına aktarın (moleküler ağırlık yaklaşık 13 kDa) ve pH 4.
'ye önceden ayarlanmış DiH2O'ya karşı diyalize edin
not: Diyaliz için DiH2O hacmi, reaksiyona giren HA çözeltisinin hacminin en az 40 katı olmalıdır (ör., 2 L DiH2O, pH 4 içinde 50 mL numune).
- Diyaliz solüsyonunu (DiH2O, pH 4) oda sıcaklığında 3 gün boyunca günde iki kez değiştirin.
- Diyaliz solüsyonunu 0,22 μm membranlı, vakumla çalışan filtreden süzün. Sıvı nitrojen içinde tiyollenmiş HA'nın flaş dondurma çözeltisi. Kuru numuneleri 2 gün boyunca dondurmak için bir liyofilizatör kullanın. Kuru formdaki tiyollenmiş HA, en az 6 ay boyunca -20 ° C'de vakumla kapatılmış bir desikatörde saklanabilir.
- Tiyolasyon derecesini belirlemek için Ellman testini ve / veya proton NMR spektroskopisini kullanın.
2. Çapraz Bağlama Malzemelerinin Hazırlanması
- Tiyollenmiş HA'yı istenen konsantrasyonda (bu örnekte, 13.3 mg / mL) HEPES tamponlu salin (Hank'in dengeli tuz salin (HBSS) tamponunda 20 mM HEPE, pH 8-9 arasına düşecek şekilde ayarlanmış) çözün ortam ışığına maruz kalmayı en aza indirmek için kehribar bir şişede. Çözeltiyi sürekli karıştırarak tutun.
not: HA'ya konjuge edilmiş tiyoller arasında disülfür bağlarının oluşumu, pH 8'in üzerindeyse, çözelti konsantrasyonu çok yüksekse veya çözelti jelleşmeden önce çok uzun süre karıştırılarak bırakılırsa meydana gelebilir. Bu sorunu önlemek için, 15 mg / mL'nin altında tiyollenmiş HA kullanın ve hidrojeller oluşturduktan sonraki 2 saat içinde tiyollenmiş HA'yı çözün.
- 50 mg / mL PEG-Mal ve PEG-tiyol stok çözeltileri hazırlamak için 4 kollu PEG-maleimid (PEG-Mal, 20 kDa) ve 4 kollu PEG-tiyol (PEG-tiyol, 20 kDa) fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde çözün.
not: PEG reaktiflerinin tamamen çözünmesi en az 1 saat sürer.
- ECM'den türetilmiş peptitler ekliyorsanız, bir stok çözeltisi hazırlamak için sistein içeren peptitleri PBS'de çözün.
not: 2-4 mM'lik bir stok konsantrasyonu kullanın.
- Silikon kauçuk kalıpları temizlemek için en az 20 dakika etanolde bekletin ve ardından sterilizasyon için otoklavlayın.
3. Hidrojel Çapraz Bağlama ve Hücre Kapsülleme
NOT: Burada bir örnek olarak, %0,5 (a/h) HA ve 1 kPa basınç modülü ile dört bireysel, 80 μL'lik hidrojelin kapsüllenmesi açıklanmaktadır3. Lütfen Tablo 1'e bakın, örneğin, farklı özelliklere sahip hidrojeller veren tarifler: integrin bağlayıcı peptit RGD'yi içeren iki hidrojel ve peptit aktivitesi için negatif bir kontrol olarak sistein kapaklarını içeren iki hidrojel. Hasta kaynaklı GBM hücrelerinin tohumlama konsantrasyonu 500.000 hücre/mL'dir.
- 120 μL PBS'ye 40 μL stok çözeltisi ekleyerek PEG-Mal stok çözeltisini (50 mg / mL, adım 2.2'den itibaren) 12.5 mg / mL'ye seyreltin. Seyreltilmiş çözeltiyi, her biri 80 μL'lik iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne bölün.
- Bir tüpe 16 μL stok RGD çözeltisi (2.8 mM, adım 2.3'ten) ve ikinci tüpe 16 μL stok sistein çözeltisi (2.8 mM, adım 2.3'ten) ekleyin. Karıştırmak için girdap. PEG-Mal-RGD veya PEG-Mal-CYS çözeltilerini adım 3.9.
'da kullanılana kadar buz üzerine yerleştirin
not: Burada tarif edildiği gibi prosedür, ~ 140 μM peptit içeren hidrojeller verir. Bu, mevcut her 8 PEG kolundan yaklaşık 1'inin bir peptit ile işgal edilmesine eşdeğerdir. Bu, sistein sonlu peptitlerin mevcut maleimid gruplarına molar oranını değiştirerek değiştirilebilir. Genel olarak, hidrojel çapraz bağlama için yeterli sayıda maleimid grubu mevcut kalırken, maksimum 280 μM peptit konsantrasyonu elde edilebilir.
- 4 μL 50 mg / mL stok çözeltisini 36 μL PBS ile karıştırarak PEG-tiyol stok çözeltisini (50 mg / mL, adım 2.2'den itibaren) 5 mg / mL'ye seyreltin. Karışıma adım 2.1'den 120 μL çözünmüş, tiyollenmiş HA ekleyin.
not: HMW HA'nın çözeltileri çok viskozdur. Bu nedenle, çözeltileri aktarmak için geniş delikli bir mikropipet ucu kullanmanızı öneririz. Solüsyonun mikropipet ucunun duvarlarına yapışmasını önlemek ve ölçüm doğruluğunu artırmak için yavaşça pipetleyin.
- Temiz, kuru kalıpları (adım 2.4'te hazırlanan) doku kültürü ile muamele edilmemiş 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin. Bir pipet ucunun temiz, keskin ucunu kullanarak jel kalıba bastırın ve kalıplar ile kuyu plakasının tabanı arasındaki sızdırmazlığı iki kez kontrol edin.
not: Sızıntıyı önlemek için kapsüllemeden hemen önce contayı tekrar kontrol edin.
- Pasaj kültürlenmiş GBM hücreleri, tek hücrelere ayrışır ve daha önce tarif edildiği gibi hücre konsantrasyonunu belirler3.
not: Bazı GBM hatları tek hücrelere ayrılamaz. Bu durumda, tüm gliomasferler kapsüllenebilir. Bununla birlikte, tekrarlanabilirliği artırmak için hassas hücre sayımından sonra ayrışmış tek hücreler hazırlayın. Gliomasfer geçişi için protokol farklı laboratuvarlar arasında farklılık gösterir ve bunların çoğu muhtemelen hidrojel kapsülleme ile uyumludur.
- (Önerilen) Gliomasferleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletine 1 mL hücre ayrışma enzimi ekleyin. Ardından, çalkalamak için tüpe hafifçe vurarak 5 dakika inkübe edin.
- Hücrelere 4 mL tam kültür ortamı (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 μg/mL heparin, G21 takviyesi ve DMEM/F12'de %1 penisilin/streptomisin) ekleyin.
- 5 dakika boyunca 500 x g'da tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Son olarak, hücre peletini tam ortamın 1 mL'sinde yeniden süspanse edin ve askıda hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. (Önerilen) Geri kazanılan hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için süzgeci 4 mL ek bir tam ortamla yıkayın.
- Bir hemositometre kullanarak süspansiyondaki hücrelerin konsantrasyonunu tahmin edin. Hücre süspansiyonunu, her tüpün ~ 80.000 hücre içerdiği 2 santrifüj tüpüne bölün. 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin; Genel olarak, 80.000 hücre 2 80 μL hidrojel oluşturacaktır.
- Süpernatanı çıkarın ve bir peleti 80 μL PEG-MAL-RGD çözeltisinde ve ikinci bir peleti 80 μL PEG-MAL-CYS çözeltisinde (adım 3.1'de hazırlanan) yeniden süspanse edin.
- 200 μL'lik geniş delikli bir mikropipet ucu kullanarak, her bir kauçuk silikon kalıba (adım 3.4'te hazırlandığı gibi) 40 μL HA çözeltisi (yukarıdaki adım 3.3'ten itibaren) dağıtın.
- 200 μL, geniş delikli bir mikropipet ucu kullanarak, 40 μL PEG-MAL-CYS veya PEG-MAL-RGD hücre çözeltisini kalıptaki HA çözeltisi ile karıştırın. En fazla 10 kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin. Hazırlanmakta olan her jel kültürü için tekrarlayın.
not: Bu adım pratik gerektirir, çünkü ilk jelleşme hızlı bir şekilde gerçekleşir (30 saniye içinde). Eşit şekilde karışmasını sağlamak için ucu kalıplarda farklı yerlere hareket ettirirken yukarı ve aşağı pipetleyin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için ucu daima sıvı seviyesinin altında tutun. Mikropipet ucunun içinde jel oluşabileceğinden solüsyonu çok fazla karıştırmayın. PEG-MAL-CYS ve PEG-MAL-RGD, istenen RGD peptit konsantrasyonunu elde etmek için değişen oranlarda birleştirilebilir.
- Reaksiyonun tamamlanmasını sağlamak için jel kapsüllü hücreleri içeren kuyucuk plakasını 5-10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Şekillendirilmiş jellerle her oyuğa 2-2.5 mL kültür ortamı ekleyin. Kalıbı ve jeli nazikçe ayırmak için steril, 2 μL'lik bir pipet ucu veya mikro spatula kullanın. Kalıbı kuyu plakasından çıkarmak için önceden sterilize edilmiş forseps kullanın. Kültür ve gelecekteki deneyler için kuyu plakasını hücre inkübatörüne (37 °C ve% 5 CO2) geri yerleştirin.
not: Jel kültürlerine zarar vermemek için kalıbı dikey olarak yukarı doğru çekin. Genel olarak, jel kültürlerindeki ortam her 3-4 günde bir değiştirilmelidir. Ortamı çıkarırken hidrojelleri aspire etmemeye dikkat edin. Bu bir sorunsa, plastik bir transfer pipeti kullanmanızı öneririz. Hücre sayısını izlemek için biyolüminesans görüntüleme planlanıyorsa, GBM hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi, kapsüllemeden önce yapısal olarak lusiferaz ekspresyonunu kodlayan lentivirüs ile dönüştürülmelidir3. Biyolüminesans görüntüleme için, lüminesans görüntülemeden 1 saat önce kültür ortamına 1 mM D-lusiferin ekleyin.
