1. Organotipik serebellar dilim kültürlerinden önce hazırlık
- Önceden% 70 etanol püskürtülmüş bir hücre kültürü davlumbazında, steril bir şişe alıcısına bağlı 250 mL'lik bir şişe üstü vakum filtresinde 200 mL kültür ortamı hazırlayın. 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), 50 mL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 50 mL ısıyla inaktive edilmiş at serumu, 1 mL 200 mM L-Glutamin (son konsantrasyon 1 mM) ve 5 mL 200 g / L glikoz (son konsantrasyon 5 mg / mL). Kültür ortamını vakumla filtreleyin ve bir aya kadar +4 °C'de tutun.
- Sterilize edilmiş biyogüvenlik kabininde, ambalajından 6 oyuklu bir kültür plakasını çıkarın. Her kuyucuğu 1 mL kültür ortamı ile doldurun. Bir tedavi test edilirse, farmakolojik ajanı tedavi edilen kuyuya ve kontrol kuyusu için aynı hacimde araç çözeltisi ekleyin. Bu çalışmada, arıtılmış kuyuya 1 μL steril 3 M KCl solüsyonu (30 mM final) ve kontrol kuyularına 1 μL steril su ilave edilmiştir.
- Hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) membranlı (gözenek boyutu = 0,4 μm) gerekli sayıda ayrı ayrı sarılmış hücre kültürü ekini hücre kültürü başlığının içine getirin. Bunları dikkatlice açın ve steril forseps ile hücre kültürü eklerini çıkarın. Bunları 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna birer birer bırakın ve ekleme zarı ile hücre kültürü ortamı arasındaki arayüzde kabarcıklardan kaçının. Kültürden önce en az 2 saat boyunca eklerin 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde ortamda dengelenmesine izin verin.
not: Doku kıyıcı kalıcı olarak hücre kültürü başlığında bulunur.
- Biri 150 mL steril su ve diğeri 150 mL %70 etanol ile doldurulmuş iki adet 200 mL beher hazırlayın. Cerrahi aletleri kullanmadan önce %70 etanol banyosuna ve ardından suya batırın.
not: Etanol ile temastan hemen sonra cerrahi aletleri kullanmayın.
- Çift kenarlı bıçağı %70 etanol kabında dezenfekte edin. Steril forseps kullanarak bıçak tutucusuna yerleştirin ve bıçak kelepçesi anahtarını kullanarak yerine tutun. Kullanana kadar kurumasını bekleyin.
- %70 etanol kabındaki doku doğrayıcı ile birlikte verilen plastik diski dezenfekte edin. Diski üzerine yerleştirmeden önce kesme tablasına %70 etanol püskürtün. Kullanana kadar kurumaya bırakın.
2. Diseksiyon ve Serebellar Organotipik Dilim Kültürleri
- Diseksiyonu gerçekleştirmek için fare yavrusunu hücre kültürü başlığının içine getirin.
- Düz çalıştırma makası kullanarak yavrunun kafasını hızlı bir şekilde kesin (Şekil 1A).
- Yavrunun başını düz pansuman forsepsleri ile burnundan tutarken, arka uçtan başlayarak orta hatta yanal olarak düz göz makası kullanarak kafa derisini kesin.
- Kafatası için aynı şekilde ilerleyin.
not: Diseksiyon sırasında beyinciğe zarar vermemek için makas uçlarını dışa doğru tuttuğunuzdan emin olun.
- Beyni çıkarın ve soğuk HBSS + 5 mg / mL glikoz ile doldurulmuş 60 mm'lik bir tabağa aktarın.
- Steril düz ince forseps kullanarak beyinciği dikkatlice inceleyin (Şekil 1B). Steril kavisli ince forseps kullanarak doku doğrayıcının kesme tablasına yerleştirilen plastik diske aktarın.
- Parasagital kesitler gerçekleştirmek için kesme tablasını döndürerek dokuyu yönlendirin.
- Tabla serbest bırakma düğmesini sağa çekerek kesme tablasını hareket ettirin, böylece bıçak dokunun kenarına yerleştirilir.
- Dilim kalınlığını 350 μm'ye ve bıçak hızını orta olarak ayarlayın.
- Doğrayıcıyı çalıştırın. Beyinciğin tamamı dilimlendikten sonra (Şekil 1C), doğrayıcıyı kapatın.
- Plastik diski steril forseps ile çıkarın.
- Plastik diski dikkatlice HBSS + 5 mg/mL glikoz içeren 60 mm'lik bir tabağa yaklaştırın. Tampon dolu kapta serebellar dilimlerin toplanmasına izin vermek için steril bir transfer pipeti kullanarak doku üzerine soğuk HBSS + 5 mg / mL glikoz pipetleyin.
- Bir mikroprob kullanarak serebellar dilimleri birbirinden ayırın. Transfer pipeti ile kaliteli bölümleri çıkarın (vermise yakın doku bölümlerinin kullanılması önerilir) ve bunları önceden dengelenmiş bir hücre kültürü ekine bırakın (Şekil 1D).
- Serebellar dilimleri mikroprob kullanarak hücre kültürü ekine yerleştirin, ardından fazla HBSS + 5 mg / mL glikoz çözeltisini transfer pipeti ile dikkatlice çıkarın.
not: Bu aşamada, doku son derece hassastır ve fiziksel hasara eğilimlidir. Hücre kültürü eki başına maksimum serebellar dilim sayısı, donör hayvanın yaşına bağlıdır. P0-P4 yaşlı bir hayvan için 6-8 dilim ve P5'ten daha yaşlı hayvanlar için 4-6 dilim kültürlenebilir.
- Kültür kabını inkübatöre yerleştirin ve ortamı her 2-3 günde bir tamamen değiştirin.
- Purkinje hücre sağkalımını değerlendirmek için, dilimler in vitro olarak 5 gün kadar erken bir sürede toplanabilir. Diğer amaçlar için, birkaç hafta boyunca kültürde tutulabilirler (Şekil 1F).
not: Purkinje hücre sağkalım deneyleri söz konusu olduğunda, hücre kültürü ortamını değiştirirken farmakolojik tedaviyi yenilemeye gerek yoktur (Şekil 1F).
3. İmmünofloresan
- 6 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın. Hücre kültürü ortamını çıkarın, hücre kültürü ekini 1x PBS ile yıkayın ve dilimleri 1 saat boyunca soğuk% 4 paraformaldehit çözeltisi ile, hücre kültürü ekinin altında 1 mL ve hücre kültürü ekinin üstünde 500 μL olacak şekilde sabitleyin.
- Uçları 4x 10 dakika 1x PBS ile, ek parçanın altında 1 mL ve üstünde 500 μL olacak şekilde bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkayın.
- Bir fırça ile, serebellar dilimleri 1 hücre kültürü ekinden 1x PBS,% 0.25 Triton X-100 ve% 3 BSA (PBS-TB), 500 μL / kuyucuk ile önceden doldurulmuş 24 oyuklu 1 oyuğa aktarın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS-TB'de inkübe ederek dilimleri geçirgen hale getirin ve bloke edin.
- PBS-TB çözeltisi içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla, gece boyunca + 4 ° C'de, 200 μL / kuyucuklu bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Ertesi gün, 500 μL/kuyucuklu bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1x PBS ile 10 dakikalık dört yıkama gerçekleştirin.
- PBS-TB çözeltisi içinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla, oda sıcaklığında iki saat, bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin ve 200 μL / kuyucuk ışıktan korunun.
- 500 μL/kuyucuklu bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1x PBS ile 10 dakikalık dört yıkama gerçekleştirin.
- Dilimleri, 1x PBS (2 μg/mL) içinde seyreltilmiş Hoechst 33342 kullanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, ışıktan korunarak, 500 μL/kuyu ile karşı boyayın.
- Serebellar dilimleri bir transfer pipeti ile bir mikroskopi slaytına monte edin. Işıktan koruyarak tamamen kurumaya bırakın. Bunları 1x PBS ile yeniden nemlendirin ve birkaç damla montaj ortamı (~ 80 μL) ile kaplı bir lamel uygulayın. Herhangi bir baloncuk yapmaktan kaçının.
- Montaj ortamı sertleştikten sonra, serebellar bölümler görüntülenmeye hazırdır.
4. Hücre Sağkalımının Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi
- Üreticiye göre mikroskobu ve lazerleri açın.
- Edinme yazılımını başlatın.
- 10X'lik bir objektif kullanarak, 9-10 lobül (genellikle vermise yakın serebellar bölümler) sunan değiştirilmemiş serebellar dilimleri bulun.
- z-stack alımını etkinleştirin. Serebellar dilimde bulunan tüm Purkinje hücrelerini içerecek şekilde z-yığınının aralığını tanımlayın. 2 μm'lik bir adım boyutu ayarlayın ve alımı başlatın. İlişkili meta verileri korumak için alınan resmi, edinme yazılımı üreticisinin biçiminde kaydedin.
- Alınan dosyayı Bio-formats eklentisini kullanarak ImageJ'de açın.
- Z projesi > Görüntü > Yığınları'na gidin... (Şekil 2A).
- Projeksiyon türü açılır menüsünde Maksimum Yoğunluk'u seçin ve Tamam'a tıklayın (Şekil 2B).
- Düzleştirilmiş bir 2-B görüntü oluşturulur. Nokta Aracı penceresinin görünmesi için Çok noktalı araca çift tıklayın. Sayılan hücrelerin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için Etiket noktaları seçeneğinin işaretini kaldırın. Ardından, saymaya başlamak için doğrudan bir Purkinje hücresinin soma'sına tıklayın (Şekil 1E). Sayılan hücrelerin toplam sayısı, Nokta Aracı penceresinin altında gösterilecektir (Şekil 3).
not: Genellikle, hücre kültürü eki başına 9-10 lobül içeren en az 3 hasarsız bölüm ölçülebilir. Bir farmakolojik ajanın nöroprotektif etkisini değerlendirmek için en az 3 bağımsız deney yapılmalıdır.
