Hipokampal Doku Örneklerinden Nöronların Ayrıştırılması ve Kültürlenmesi

Özet

Kaynak: Servello, D. et al., Merkezi Nöron Aksonlarında Varis Oluşumunu ve İyileşmesini İncelemek için Bir Mikrobiyomekanik Sistem. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, enzimatik ve mekanik ayrışmalar kullanarak hipokampal doku örneklerinden hipokampal nöronların ayrışmasını ve kültürünü göstermektedir. Ara-C ile tedavi, nöronal olmayan hücrelerin büyümesini inhibe ederek hipokampal nöronların seçici büyümesini kolaylaştırır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Gebe Fare/Sıçandan Hipokampal Nöronların Diseksiyonu, Dissosiyasyonu ve Kültürü

1. Kültür için hipokampal nöronların diseksiyonu ve dissosiyasyonu
   1. Proteaz enzim çözeltisini (Dilim diseksiyon çözeltisinde 3 mg / mL proteaz 23, SLDS, Tablo 1) ve ön sıcak kaplama ortamını (Tablo 2) 37 ° C'de çözdürün.
   2. Hipokampusu inceleyin ve SLDS.
      ile durulayın not: Dört hipokampus, bir adet 24 oyuklu veya bir adet 6 oyuklu plaka için yeterli hücre sağlar.
   3. SLDS'yi çıkarın, 2 mL proteaz enzim çözeltisi ekleyin ve numuneyi 37 °C, %5 CO_2'de 15 dakika inkübe edin.
   4. Hipokampus eksplantlarını 5-10 mL kaplama ortamı ile iki kez yıkayın. 5 mL kaplama ortamı ekleyin. 1 mL plastik uçlu bir pipet kullanarak küçük bir girdap oluşturarak hipokampal eksplantları tek hücrelere ayırın. Çözelti bulanıklaşana ve büyük eksplant parçaları kalmayana kadar oksijen kabarcıklarının oluşmasını önleyerek yaklaşık 40 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
      not: Yıkama sırasında bazı ortamlar bırakmayı unutmayın, hipokampal eksplantlar tüm süreç boyunca ortama batırılmış kalmalıdır.
   5. Hücreleri 3 dakika boyunca 1.125 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı, ortamlara batırılmış hücrelerle çıkarın. Hücreleri 145 mL kaplama ortamında yeniden süspanse edin. 24 oyuklu bir plakaya 1 mL / kuyucuk hücre süspansiyonu ekleyin (6 oyuklu bir plakaya 3 mL / oyuk).
      NOT: Düşük hücre yoğunluğuna sahip bir hücre süspansiyonu üretmek için 145 mL kaplama ortamı kullanılır. Bu hacim, yapılacak deneylere bağlı olarak hücrelerin altı adet 24 oyuklu plakaya, sekiz adet 6 oyuklu plakaya veya 24 veya 6 oyuklu plakaların çeşitli kombinasyonlarına kaplanmasına izin verecektir. 24 oyuklu plakanın her bir oyuğu yaklaşık 3 x 10⁴ hücreye sahip olacaktır.
   6. Kaplama ortamındaki hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 2-4 saat inkübe edin, ardından tüm kaplama ortamını çıkarın ve yeni bakım ortamı ile değiştirin.
   7. 2 gün sonra (2 gün in vitro, 2DIV), ortamın yarısını, fibroblastların, endotel ve glial hücrelerin büyümesini inhibe eden bakım ortamında çözünmüş 2 μM Ara-C (arabinosilsitozin) ile değiştirin. Hücreleri iki gün boyunca Ara-C'ye maruz bıraktıktan sonra, ortamı yeni bakım ortamıyla değiştirin.

Tablo 1: Lamel kaplama çözeltisi. Kültürlenmiş hücreleri lamellere yapıştırmak için kullanılan lamel kaplama çözeltisinin hazırlanması için reçeteyi sağlar.

Lamel kaplama çözümü
780 μL	Asetik asit17 mM stoğu: 50 mL H2O içinde 50 μL asetik asit
200 μL	Poli-D-lizin (0.5 mg / mL stok)
20 μL	Sıçan kuyruğu kollajeni (3 mg/mL stok)
Toplam hacim, kaplanacak lamel sayısına göre belirlenir.

Tablo 2: Hücre kültürü ortamı tarifleri. Birincil hipokampal nöron hücrelerinin kültürlenmesinde kullanılan ortamların hazırlanması için tarifler sağlar.

>1x Dilim diseksiyon çözeltisi (SLDS), filtrelenmiş, pH= 7.4, 4 °C'de saklayın
1 L	ddH2O
82 milyon	Na2SO4
30 milyon	K2YANI4
10 milyon	HEPES (serbest asit)
10 milyon	D-glikoz
5 milyon	MgCl2
%0,00	Fenol kırmızısı (isteğe bağlı)
Kaplama Ortamı (PM, filtre, 4 °C'de saklayın)
439 mL	MEM Earle'ün Tuzları
50 mL	FBS (FBS)
11,25 mL	% 20 D-glikoz
5 mL	Sodyum piruvat (100 mM,)
62,5 μL	L-glutamin (200 mM)
5 mL	Penisilin / Streptomisin (P / S, 100x)
Bakım Ortamı (MM, filtre, 4 °C'de saklayın)
484 mL	Nörobazal
10 mL	B27 50x takviyesi
1,25 mL	L-glutamin (200 mM)
5 mL	100x P/S
Tüm solüsyonlar 0,2 mm gözenek boyutuna sahip bir filtre kullanılarak sterilize edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 mm lamel	Warner Enstrümanları	64-0702	24 oyuklu plaka için
25 mm lamel	Balıkçı Bilimsel	12-545-102	6 oyuklu plaka için
asetik asit	Balıkçı Bilimsel	A38-212
Poli-D-lizin	Sigma	P6407 Serisi
Sıçan kuyruğu kollajen	Roche	11 179 179 001
10 kat PBS	Ulusal Teşhis	CL-253
Na2SO4	Balıkçı Bilimsel	S373-500 Serisi
K2SO4	Balıkçı Bilimsel	P304-500
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Balıkçı Bilimsel	BP410-500
D-glikoz	Balıkçı Bilimsel	D16-500
MgCl2	Balıkçı Bilimsel	BP214-500
NaOH (NanoOH	Balıkçı Bilimsel	SS255-1
Proteaz enzimi	Sigma	P4032 Serisi
FBS (FBS)	Gibco (Gibco)	26140
Sodyum piruvat	Gibco (Gibco)	11360-070
L-glutamin	Gibco (Gibco)	25030081
Penisilin / Streptomisin 100x (P / S)	Gibco (Gibco)	15140122
MEM Earle'ün Tuzları	Gibco (Gibco)	11090
B27 takviyesi	Gibco (Gibco)	17504-044
Nörobazal	Gibco (Gibco)	21103-049
Arabinosilsitozin (Ara-C)	Sigma	147-94-4
Opti-MEM ortamı	Gibco (Gibco)	31985-070

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi ) Serisi