Yöntem makalesi

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Oligodendrositlere Farklılaşması

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Assetta, B., et al. Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerinin Modellenmesi için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerinin Üretilmesi. J. Vis. Deneyim (2020).

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinden oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) üretilmesi sürecini ve ardından OPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını göstermektedir. Bu oligodendrosit üretme süreci, Alzheimer da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların araştırma ve tedavisini iyileştirmek için çok sayıda yol açar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pluripotent kök hücrelerden insan oligodendrosit öncü hücre (OPC) indüksiyonu ve oligodendrosit olgunlaşması

  1. Nöral Progenitör Hücre (NPC) üretimi: tek katmanlı protokol (~ 7 gün). Akış şeması için Şekil 1A'ya bakın.
    1. 52'nin geçişinde ticari olarak temin edilebilen H1 insan ES hücrelerini kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreleri, hücre dışı matris çözeltisi kaplı 6 oyuklu plakalar (6 oyuklu plaka başına ~ 0.5 mg matris çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız) ES hücre bakım ortamı kullanarak kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve plakaları% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Çoklu sinyal yolları için küçük molekül inhibitörleri ile çift SMADi adı verilen yerleşik bir yaklaşımla hücreleri nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) dönüştürün. Burada yaygın olarak kabul edilen bir ticari kit kullanıyoruz ve üretici tarafından sağlanan tek katmanlı protokolü takip ediyoruz (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. -1. Günde, büyüme faktörü indirgenmiş bir matris çözeltisi ile kaplanmış 6 oyuklu bir plakada (bkz. Malzeme Tablosu; 6 oyuklu plaka başına ~ 0.5 mg matris çözeltisi) embriyonik kök (ES) hücre bakım ortamı ile (bkz. Malzeme Tablosu). Bu büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisi, aşağıdaki adımlarda kullanılacak tüm plakaları kaplamak için kullanılır.
    4. 0. Günde, hücreleri 24 saat boyunca% 2 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş ES hücre bakım ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.
    5. 1-6. Günde, tam ortamı ticari kitten SMAD inhibitörlerini içeren ılık (37 ° C) bir nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Hücreler 7. günden önce bölünür ve birleşirse, bunları daha önce adım 1.1.3'te açıklandığı gibi 0,5–1 x 106 tohumlama yoğunluğuna geçirin.
    6. 7. Günde, hücre ayırma solüsyonu (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 24 oyuklu bir plakanın 1-2 x 105 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğunda plaka kullanarak NPC'leri geçin.
    7. OCT4 gibi pluripotens belirteçlerinin yokluğu ve PAX6, Nestin ve Sox1 gibi NPC belirteçlerinin varlığı için immünohistokimyasal (IHC) boyama ile test farklılaşma etkinliği.
    8. Bu aşamada, ayrılan NPC'ler özel ticari NPC dondurma ortamında dondurulabilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 aya kadar sıvı nitrojen içinde saklanabilir. Bir kez dondurulup çözüldükten sonra, NPC'ler, güvenilir protokollere sahip nöronlara, astrositlere ve OPC'lere yol açmak için çoklu gücü hala korur.
  2. Oligodendrosit öncü hücre (OPC) üretimi (~ 7 gün). Akış şeması için lütfen Şekil 1A'ya bakın.
    1. 7. Günde, hücre ayırma solüsyonu kullanarak NPC'leri geçin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları ılık (37 ° C) nöral indüksiyon ortamında 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 1-2 x10 5 hücre tohumlama yoğunluğunda plakalayın ve ticari kitten SMAD inhibitörleri (bkz.
    2. 8. Günde, OPC farklılaşma ortamında %1 DMSO'luk bir çözelti hazırlayın ve kaplanmış NPC'leri 24 saat boyunca tedavi edin. OPC farklılaşma ortamı şunlardan oluşur: bazal (DMEM / F12) ortamı,% 1 N2 takviyesi,% 1 B27 takviyesi,% 20 ng / mL'de temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 1 μM'de düzleştirilmiş agonist (SAG), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA) 10 ng / mL'de (bkz.
    3. 9. Günde, ortamı DMSO'suz yeni OPC farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Hücreleri 15. güne kadar her gün besleyin. Hücreler 15. günden önce birleşirse, bunları adım 1.2.1'de açıklandığı gibi oyuk başına 1-2 x10 5 hücreli tohumlama yoğunluğuna geçirin.
    4. 14. Günde, 24 oyuklu bir plakada 1-2 x 105 hücre / kuyu yoğunluğunda OPC farklılaşma ortamındaki plaka OPC'leri.
    5. Bu aşamada (15. gün), immünohistokimya (IHC) boyama veya kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile OPC'ye özgü belirteçlerin varlığı için hücreleri test edin (ör., O4, Olig1 / 2, CSPG4 / Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Şekil 1B) ve NPC işaretleyicilerinin olmaması için (Pax6 veya Nestin; Şekil 1D). Tipik olarak 15. günde hücrelerin %95'inden fazlasında O4 immünoreaktivitesini tespit ederiz. Alzheimer hastalığı ile özellikle ilgili olarak, APP (amiloid öncü proteini), BACE1 (işleme proteazı β-sekretaz 1) ve peptit amiloid-β (Aβ) ekspresyonu OPC'lerde bol miktarda bulunur (Şekil 1F).
  3. Oligodendrosit (OL) olgunlaşması (~ 7-20 gün)
    1. 15. Günde, ortamı OL olgunlaşma ortamı ile değiştirin: Nörobazal-A ortamı,% 2 B27 takviyesi, 1 μM siklik adenozin monofosfat (cAMP), 200 ng / mL T3 triiyodotironin ve 1 μM'lik Klemastin (bkz. Gerekirse ortamı iki günde bir veya her gün değiştirin.
    2. Hücreler %90 birleşmeye ulaştığında, 1:3 oranında 2 geçişe kadar veya hücre bölünmesi önemli ölçüde yavaşlayana kadar bölün. OPC'ler çok hızlı bölünür ve 3 günden daha kısa sürede birleşirse, 1-3 gün boyunca 2-5 μM konsantrasyonda Ara-C (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Aktif proliferasyon, olgunlaşma verimliliğinin düşük olduğunu gösterir.
    3. OL belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek oligodendroglial olgunlaşmanın verimliliğini inceleyin, ör., CLDN11, PLP1, qPCR, IHC boyama veya immünoblotlama ile MBP. Oldukça karmaşık yapıların karakteristik morfolojisi (Şekil 1C) ve OL belirteçlerinin ekspresyonu (Şekil 1E) 28. güne kadar kolayca tespit edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: iOPC (indüklenmiş oligodendrosit öncü hücre) üretimi ve iOL (indüklenmiş oligodendrosit) olgunlaşması. (A) iOPC ve iOL üretiminin akış diyagramı. (B) 15. günde iOPC'lerin temsili parlak alan ve immünofloresan görüntüleri. Olig2 (pan-oligodendroglia markörü) yeşil, O4 (OPC markörü) kırmızı ve DAPI mavi ile gösterilmiştir. Görüntüleme, iOPC'lerin %>95'inin O...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AktatazKÖK HÜCRE Teknolojileri7920
B27 takviyesiThermoFisher (Termo Balıkçı)17504044
bFGF (İngilizce)ThermoFisher (Termo Balıkçı)PHG 0266
kampMilliporeSigmaA9501
KlemastinMilliporeSigmaSML0445
DMEM/F12 ortaKÖK HÜCRE Teknolojileri36254
DMSO (Türkçe)ThermoFisher (Termo Balıkçı)D12345
Fetal Sığır SerumuScienCell (Bilimsel)10
H1 insan ES hücreleriWi HücresiWA01
Matrigel (Matrijel)Corning354234
mTeSR artıKÖK HÜCRE Teknolojileri5825
N2 takviyesiThermoFisher (Termo Balıkçı)17502001
Nörobazal A ortamıThermoFisher (Termo Balıkçı)10888-022
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerThermoFisher (Termo Balıkçı)11140-050
PDGF-AA (AAAr-Ge Sistemleri221-AA-010
pMDLg/pRREEkle12251
PolibrenMilliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVEkle12253
KAYA İnhibitörü Y-27632KÖK HÜCRE Teknolojileri72302
sarkmakTocris (Türkçe)4366
STEMdiff Nöral Progenitör Dondurma OrtamıKÖK HÜCRE Teknolojileri5838
STEMdiff SMADi Nöral İndüksiyon KitiKÖK HÜCRE Teknolojileri8581
T3 triiyodotironinMilliporeSigmaT6397
Tempo-iOlogo: İnsan iPSC'den türetilen OPC'lerTempo BiyobilimSKU102
TetO-NG2-PUROEkle52047
VSV-GEkle12259
adet Serisi Serisi Serisi ) sayılı Kanun Hükmünde Kararname adet Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oligodendrosit DiferansiyasyonuN ral Progenit r H crelerOligodendrosit nc H creleriSMAD nhibit rleriDMSO UygulamasH cre Ay rma Sol syonuOPC Diferansiyasyon BesiyeriOL Mat rasyon BesiyeriAra C Uygulamas

İlgili makaleler