$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İnsan pluripotent kök hücrelerinden insan nöron indüksiyonu
- Lentivirus hazırlığı (~ 5 gün)
- Plaka ~ 1 milyon İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücresi her T75 şişesi, transfeksiyon gerçekleştirirken ~% 40 birleşik olmalarını sağlamak. Bunları tetrasiklin ile indüklenebilir nörogenin 2 (Ngn2) ve puromisine dirençli geni (PuroR; aynı Tet operatörü (TetO) promotör kontrolü altında), ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) ve üç yardımcı plazmit pRSV-REV, pMDLg/pRRE ve VSV-G (12 μg lentiviral vektör DNA'sı ve yardımcı plazmit DNA'nın her birinin 6 μg'ı) eksprese eden plazmitlerle transfekte edin. Lentivirüs preparatı başına en az üç şişe hazırlayın. Üreticinin talimatına uyarak transfeksiyon için polietilenimin (PEI) kullanın. Ortamı 16 saat sonra değiştirin ve atın.
- Her gün kültür ortamını toplayarak salınan viral parçacıkları hasat edin ve 3 gün boyunca taze ortamla değiştirin. Saflaştırma için viral partiküller içeren toplanan ortamı bir araya getirin. Virüsü 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 90 dakika boyunca 49.000 x g'da santrifüjleyin. Peletleri uygun hacimde fosfat tamponlu salin (PBS)-glikoz (~ 150 μL) içinde yeniden süspanse edin.
- Nöron İndüksiyonu (~ 5 gün)
not: Bu indüksiyon protokolü (Şekil 1A; akış diyagramı) hem indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hem de doğrulanmış pluripotentliğe sahip embriyonik kök (ES) hücreleri için oldukça etkilidir (bu, iyi karakterize edilmiş pluripotens belirteçlerinin immünohistokimya boyaması ile test edilebilir; Şekil 1B).
- 52'nin geçişinde ticari olarak temin edilebilen H1 insan ES hücrelerini kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreleri, hücre dışı matris çözeltisi kaplı 6 oyuklu plakalar (6 oyuklu plaka başına ~ 0.5 mg matris çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız) ES hücre bakım ortamı kullanarak kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve plakaları 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
- -2. Günde, ES hücrelerini (% 80 birleşik) 1 mL hücre ayırma çözeltisi ile ayırın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri bir tüpe aktarın; İyiliği 2 mL ortamla yıkayın ve aynı tüpte birleştirin. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, peleti ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri, oyuk başına 1 x 105 hücrelik tohumlama yoğunluğunda matris kaplı 6 oyuklu plakalara yerleştirin.
- -1. Günde, Ngn2 artı PuroR ve rtTA'yı polibren (8 μg / ml) ile birlikte eksprese eden lentivirüsleri taze ES hücre bakım ortamındaki ES hücrelerine ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Virüslerin tam sayısı, gerçek titreler veya titrasyon ile belirlenmelidir. Tipik olarak 6 oyuklu bir plakada her bir virüsü oyuk başına 5 μL ekleriz.
- 0. Günde, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı / besin karışımı F-12 (DMEM-F12) ortamına morfojen içermeyen N2 takviyesi ile Doksisiklin (Ngn2 ekspresyonunu aktive etmek için 2 μg / mL) ekleyin.
- 1. Günde, 1 μg / mL ortamın son konsantrasyonuna kadar taze DMEM-F12 artı N2 ve doksisiklin ortamında Puromisin ekleyin. Virüs titresi düşükse, yetersiz transdüksiyonlu hücreleri yeterince çıkarmak için daha yüksek Puromisin konsantrasyonu (5 μg / mL'ye kadar) ve daha uzun seçim süresi (48 saate kadar) gerekebilir.
- 2. Günde, farklılaşan nöronları hücre ayırma solüsyonu ile ayırın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları matris solüsyonu ile kaplanmış 24 oyuklu plakalara (80.000-200.000 hücre / kuyu arasında) yeniden plakalayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve bunları doksisiklin içermeyen nörobazal-A (NBA) / B27 ortamında tutun. Tohumlama yoğunluğu kritiktir.
- Bu aşamada, ayrılan nöronlar özel ticari dondurma ortamında dondurulabilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 aya kadar sıvı nitrojen içinde saklanabilir. Saf nöronlar, çözülme sonrası tipik ~%15-%20 hücre ölümü hesaba katılarak kaplanabilir, tek başına kültürlenebilir veya diğer beyin hücresi tipleriyle birlikte kültürlenebilir (OPC'lerle birlikte kültürleme için bkz. adım 3.2.3.).
- Üretici tarafından talimat verildiği şekilde hücre dışı matris bazlı çözeltilerle kaplanmış plakalar üzerindeki saf iN'leri kültürleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Karakteristik piramidal morfoloji 4. günde (ve 6. gün; Şekil 1C). Sinaps oluşumu 14. ila 16. gün gibi erken bir sürede tespit edilebilir ve 24. günde standart pre- ve post-sinaptik belirteçlerle immünohistokimyasal boyama ile belirgindir. (Şekil 1D; pre-sinaptik belirteç Synapsin 1 ve dendritik belirteç Map2 ile etiketlenmiştir).
2. Pluripotent kök hücrelerden insan oligodendrosit öncü hücre (OPC'ler) indüksiyonu ve oligodendrosit olgunlaşması
- Nöral Progenitör Hücre (NPC) üretimi: tek katmanlı protokol (~ 7 gün). Akış şeması için Şekil 2A'ya bakın.
- Daha önce tarif edildiği gibi H1 insan ES hücrelerini kültürleyin (bkz. adım 1.2.1.) ve çoklu sinyal yolları için küçük molekül inhibitörleri ile ikili SMADi adı verilen yerleşik bir yaklaşımla bunları nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) trans-farklılaştırın. Burada yaygın olarak kabul edilen bir ticari kit kullanıyoruz ve üretici tarafından sağlanan tek katmanlı protokolü takip ediyoruz (bkz. Malzeme Tablosu).
- -1. Günde, büyüme faktörü indirgenmiş bir matris çözeltisi ile kaplanmış 6 oyuklu bir plakada (bkz. Malzeme Tablosu; 6 oyuklu plaka başına ~ 0.5 mg matris çözeltisi) ES hücre bakım ortamı ile 0.5–1 x 106 hücre plakası (bkz. Bu büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisi, aşağıdaki adımlarda kullanılacak tüm plakaları kaplamak için kullanılır.
- 0. Günde, hücreleri 24 saat boyunca% 2 DMSO ile desteklenmiş ES hücre bakım ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.
- 1-6. Günde, tam ortamı ticari kitten SMAD inhibitörlerini içeren ılık (37 ° C) nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Hücreler 7. günden önce bölünür ve birleşirse, bunları daha önce adım 2.1.2'de açıklandığı gibi 0,5–1 x 106 tohumlama yoğunluğuna geçirin.
- 7. Günde, hücre ayırma solüsyonu (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 24 oyuklu bir plakanın 1-2 x 105 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğunda plaka kullanarak NPC'leri geçin.
- Örneğin pluripotens markörü, Oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4 (OCT4) ve eşleştirilmiş kutu 6 (PAX6), Nestin ve cinsiyet belirleme bölgesi Y-kutusu transkripsiyon faktörü 1 (Sox1) gibi NPC belirteçlerinin varlığı için immünohistokimyasal (IHC) boyama ile farklılaşma etkinliğini test edin.
- Bu aşamada, ayrılan NPC'ler özel ticari NPC dondurma ortamında dondurulabilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 aya kadar sıvı nitrojen içinde saklanabilir. Bir kez dondurulup çözüldükten sonra, NPC'ler, güvenilir protokollere sahip nöronlara, astrositlere ve OPC'lere yol açmak için çoklu gücü hala korur.
- Oligodendrosit öncü hücre (OPC) üretimi (~ 7 gün). Akış şeması için lütfen Şekil 2A'ya bakın.
- 7. Günde, hücre ayırma solüsyonu kullanarak NPC'leri geçin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları ılık (37 ° C) nöral indüksiyon ortamında 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 1-2 x10 5 hücre tohumlama yoğunluğunda plakalayın ve ticari kitten SMAD inhibitörleri (bkz.
- 8. Günde, OPC farklılaşma ortamında %1'lik bir dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi hazırlayın ve kaplanmış NPC'leri 24 saat boyunca tedavi edin. OPC farklılaşma ortamı şunlardan oluşur: DMEM/F12 ortamı, %1 N2 takviyesi, %1 B27 takviyesi, 20 ng/mL'de temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 1 μM'de düzleştirilmiş agonist (SAG), trombosit kaynaklı büyüme faktörü-AA (PDGF-AA) 10 ng/mL'de (bkz.
- 9. Günde, ortamı DMSO'suz yeni OPC farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Hücreleri 15. güne kadar her gün besleyin. Hücreler 15. günden önce birleşirse, bunları adım 2.2.1'de açıklandığı gibi kuyu başına 1-2 x10 5 hücre tohumlama yoğunluğuna geçirin.
- 14. Günde, 24 oyuklu bir plakada 1-2 x 105 hücre / kuyu yoğunluğunda OPC farklılaşma ortamındaki plaka OPC'leri.
- Bu aşamada (15. gün), IHC boyama veya qPCR ile OPC'ye özgü belirteçlerin varlığı için hücreleri test edin (ör., O4, oligodendrosit soy transkripsiyon faktörü [Olig]-1/2, Kondroitin sülfat proteoglikan 4 / nöron-glial antijen 2 [CSPG4 / Ng2 [, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa [PDGFRa]; Şekil 2B) ve NPC işaretleyicilerinin olmaması için (Pax6 veya Nestin; Şekil 2D). Tipik olarak 15. günde hücrelerin %95'inden fazlasında O4 immünoreaktivitesini tespit ederiz. Alzheimer hastalığı ile özellikle ilgili olarak, APP (amiloid öncü proteini), BACE1 (işleme proteazı β-sekreataz 1) ve peptit amiloid-β (Aβ) ekspresyonu OPC'lerde bol miktarda bulunur (Şekil 2F).
>3. İnsan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) birlikte kültürlenmesi
- iOPC kaplama (~3 gün)
- OPC farklılaşma ortamında (adım 2.2.2.2.'de açıklandığı gibi) 24 oyuklu bir plakada (yukarıda adım 2.2.4'te açıklandığı gibi) kuyucuk başına 1 x 105 hücre yoğunluğunda 14. günde plaka iOPC'leri.
- iN-iOPC ortak kültür kurulumu
- 15. Günde, Puromisin seçiminden sonraki 2. günün adımında (adım 1.2.6'da açıklandığı gibi) indüklenen insan nöronlarını hücre ayırma çözeltisi ile ayırın (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kültürlenmiş OPC'lerin üzerine nöronlar ekleyin, büyüyen OPC'lerle 24 oyuklu plakada oyuk başına 2 x 105 hücre tohumlama yoğunluğunda kaplama yapın (adım 3.1.1'den itibaren). Nörobazal-A ortamı,% 2 B27 takviyesi ve% 100 ng / mL T3 triiyodotironin içeren ko-kültür ortamını kullanın. Ortamı ertesi gün ve daha sonra her gün değiştirin. OPC'ler çok hızlı çoğalır ve 3 günden daha kısa sürede birleşirse, 2-5 μM konsantrasyonda sitozin arabinozit (Ara-C) ekleyin. 7 günlük nöronlardan sonra ko-kültürde yetiştirilen iN'lerin ve iOPC'lerin temsili bir görüntüsü Şekil 3A'da gösterilmektedir.
- OPC'lerle birlikte kültürleme için yukarıda adım 1.2.7'de açıklandığı gibi hazırlanan donmuş nöronları kullanın. Plaka donma ve çözülme nöronları, kuyu başına 3 x 105 hücreden daha yüksek bir yoğunlukta.
- Ko-kültürlerde 14-16. günden sonra, iN'lerdeki sinaps oluşumu, sinaptik öncesi ve sonrası belirteçlerin IHC boyaması ile gözlemlenebilir ve 21. güne kadar sinaptik punkta bol olmalıdır (Şekil 3C) ve nöronal aktiviteler güvenilir bir şekilde kaydedilebilir.
- 21. günden başlayarak, hücreleri OL spesifik belirteçler için test edin (örneğin, miyelin bazik proteini [MBP] ve proteolipid proteini 1 [PLP1]). 28. Günde, normal olarak, spesifik belirteçler için IHC boyama ile etiketlenen iN aksonlarının iOL süreçleri ile kılıflanması fenomenini gözlemleriz (Şekil 3B; iN aksonları için nörofilament [NF] ve iOPC süreçleri için MBP).
