>1. Deney hazırlığı
- Bodrum membran matrisi (BMM) kaplı plakaları hazırlayın.
not: BMM, daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı katılaşır. Plakalar hızlı bir şekilde hazırlanmalı ve depolama için hemen 4 °C'ye yerleştirilmelidir.
- BMM'yi (Malzeme Tablosuna bakın) buz üzerinde, 4 °C'de en az 2 saat veya gece boyunca çözdürün.
- Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) / F12 ve BMM'yi 80 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona karıştırın. BMM çözeltisini doku kültürü kaplarına dağıtın (35 mm için 1 mL ve 60 mm tabaklar için 2 mL) ve hücreleri kaplamadan önce en az 1 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Kullanılmayan bulaşıklar 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
- Poli-L-ornitin/laminin (PLO/laminin) kaplı plakalar hazırlayın.
- Steril Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS +/+) 20 μg / mL PLO (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Ertesi gün, FKÖ'yü bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve DPBS+/+ ile iki kez yıkayın. Davlumbazda havayla kurutun.
NOT: Havayla kurutulmuş plakalar, ileride kullanılmak üzere alüminyum folyoya sarılarak 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- DPBS +/+ 'da 10 μg/mL laminin (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde en az 3 saat veya gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Laminini bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 1 mL orta veya steril DPBS+/+.
ekleyin
NOT: Laminin kaplama kurumamalıdır. Bunu önlemek için PBS veya uygun bir kültür ortamı hemen eklenmelidir. Kaplamalı plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- PSC geçiş çözümünü hazırlayın.
- 11.49 g potasyum klorür (KCl) ve 0.147 g sodyum sitrat dihidratı (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) 400 mL steril hücre kültürü dereceli suda çözün (bkz.
- Çözeltinin hacmini ölçün ve bunu ilk hacim (Vi) olarak kaydedin.
- Ozmolariteyi ölçün ve 570 mOsm × Vi × Oi = Vf formülünü kullanarak steril hücre kültürü dereceli su ekleyerek 570 mOsm'ye ayarlayın.
- Çözeltiyi 0.20 μm'lik bir filtre ile filtre-sterilize edin ve 10 mL alikotlar yapın. Alikotları oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.
- Pluripotent kök hücre (PSC) ortamı hazırlayın.
NOT: iPSC'ler, ısıya dayanıklı Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) (Malzeme Tablosuna bakınız) içeren bir ortamda tutulur ve hafta sonu ücretsiz bir beslenme programı sağlar. Piyasada bulunan diğer PSC ortamları bu protokol için denenmemiştir.
- PSC ortam takviyesini gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
- 500 mL bazal PSC ortamına 10 mL PSC ortamı takviyesi ekleyin. 25 mL alikot yapın ve -20 °C.
'de saklayın
NOT: Dondurulmuş alikotlar -20 °C'de 6 ay saklanabilir. Çözülmüş alikotlar 4 °C'de saklanmalı ve 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Hücreler, %10 (h/h) dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir PSC ortamında uzun süreli depolama için dondurulabilir.
- PSC çözdürme ortamını hazırlayın.
- PSC ortamını 50 nM chroman, 1.5 μM emricasan, 1x poliamin takviyesi ve 0.7 μM trans-ISRIB (CEPT kokteyli) ile destekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 0,20 μm'lik bir filtre ile filtre-sterilize edin ve 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
- Çekilmiş cam pipetleri hazırlayın.
- 22,9 cm (9 inç) cam Pasteur pipetlerini bir Bunsen brülörünün üzerinde, boynun ~2 cm altında iki parça halinde çekin ve daha ince tarafı diğerinden ~4 cm daha kısa olacak şekilde iki pipet oluşturun.
- Alevin yardımıyla, pürüzsüz bir "r" oluşturmak için çekilen tarafın uçlarını bükün.
- Çekilen pipetleri otoklav kılıflarına yerleştirin ve sterilizasyon için otoklava yerleştirin.
- Serebellar farklılaşma ortamı (CDM) hazırlayın.
- Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unu (IMDM) ve Ham'ın F12 besin karışımını 1:1 oranında karıştırın. Karışımı 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi,% 1 (h / h) kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi, 0.45 mM 1-tiyo-gliserol, 15 μL / mL apo-transferrin, 5 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 7 μg / mL insülin ile destekleyin (bkz.
- 0,20 μm filtre ile filtre-sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.
- Serebellar olgunlaşma ortamını (CMM) hazırlayın.
- Nörobazal ortamı 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi ve 1x N-2 takviyesi ile destekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 0,20 μm'lik bir filtre ile filtreyle sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde kullanın.
2. Besleyici içermeyen iPSC kültürü
- Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri çözün.
- Hücreleri çözmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca jelleşmek için 37 ° C inkübatöre bir BMM plakası (adım 1.1) yerleştirin.
- 10 mL PSC çözdürme ortamını (adım 1.5) 37 °C'de önceden ısıtın.
- Kriyoviyal hücreleri ile sıvı nitrojenden 37 °C.
'de bir su banyosuna aktarın
NOT: Hücre kültürü alanında bir kontaminasyon kaynağı oluşturmasını önlemek için standart bir su banyosu kullanılması önerilmez. Bunun yerine, tek kullanımlık bir su banyosu oluşturmak için tatlı su küçük bir beherde 37 °C'ye kadar ısıtılabilir.
- Tüpte küçük bir buz parçası kaldığında, su banyosundan çıkarın, tüpü kurutun ve% 70 etanol püskürtün. Tüpü davlumbaza aktarın ve hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe nazikçe aktarmak için 2 mL veya 5 mL'lik bir serolojik pipet (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
- Konik tüpü döndürürken hücrelere damla damla 8 mL PSC çözdürme ortamı ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini bozmadan süpernatanı bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Hücreleri 2 mL PSC çözdürme ortamında yeniden süspanse edin.
- BMM'yi plakadan aspire edin ve eşit dağılım için yeniden süspanse edilmiş hücreleri plakanın her yerine damla damla ekleyin.
- Plakayı 37 °C,% 5 CO2 olacak şekilde inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün ortamı PSC ortamı ile yenileyin. Bundan sonra, ortamı günlük olarak değiştirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hücrelerin bakımını yapın.
- Gerekli PSC ortamı hacmini 37 °C'de önceden ısıtın (örn., 35 mm plaka başına 1 mL ortam).
- Farklılaşmış hücreler veya koloniler için plakaları inceleyin ve farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipetle çıkarın (adım 1.6).
NOT: iPSC kolonileri, morfolojik olarak aynı hücrelere sahip pürüzsüz kenarlara sahiptir.
- Harcanan ortamı günlük olarak değiştirin ve her 3-4 günde bir veya% 70 izdihama ulaşıldığında geçişi yapın.
- Hücreleri geçit.
- Geçmeden önce gerekli miktarda BMM plakasını en az 1 saat veya gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Gerekli miktarda PSC ortamını (adım 1.3) 37 °C'de önceden ısıtın.
- Çekilmiş bir cam pipet kullanarak, farklılaşmış hücreleri veya kolonileri temizleyin.
- Harcanan ortamı bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 35 mm'lik çanak başına 1 mL PSC ayrışma ortamı ekleyin. 37 °C'de 1-3 dk.
inkübe edin
NOT: PSC ortamı eklenmeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.
- PSC pasaj çözeltisini aspire edin ve önceden ısıtılmış PSC ortamı ekleyin.
- Steril 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, çizik çizgileri tek yönde birbirine paralel hale getirin, plakayı 90° çevirin ve öncekilere dik ikinci bir çizik çizgisi seti oluşturun (plaka boyunca çapraz çizgili bir desen oluşturarak).
- BMM çözeltisini ayar plakalarından aspire edin. Kolonileri serolojik bir pipet kullanarak toplayın ve yeni BMM plakalarına dağıtın.
- 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin. Ortamı günlük olarak değiştirin.
- Hücreleri dondurun.
- İçeriği etiketleyerek kriyoviyalleri hazırlayın ve başlıkta ultraviyole (UV) ışık altında 30 dakika sterilize edin (Malzeme Tablosuna bakın).
- PSC ortamını %10 (h/h) DMSO ile takviye ederek PSC dondurma ortamını hazırlayın. 2.3.2-2.3.5 adımlarını izleyin.
- Hücreleri 5 mL'lik serolojik pipet ile 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini PSC dondurma ortamında yeniden süspanse edin.
- Kriyoviallere dağıtın. Şişeleri bir dondurma kabına koyun ve kabı -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
- Ertesi gün, kriyoviyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.
>3. Serebellar farklılaşma
>NOT: Farklılaşmaya başlamadan önce, iPSC'ler altı adet 35 mm'lik çanağa geçirilir ve %70 birleşim noktasına geldiklerinde farklılaşmaya hazırdır. Her 35 mm'lik plaka, 6 oyuklu plakanın bir kuyusuna aktarılacaktır.
- 0. günde, EB oluşumu için sağlıklı iPSC kolonilerini kaldırın.
- 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ile takviye edilmiş 1 mL CDM (adım 1.7) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) 6 oyuklu ultra düşük ekli (ULA) plakanın her bir oyuğuna ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin.
- Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin. Ortamı aspire edin ve her 35 mm'lik tabak için 1 mL PSC pasaj solüsyonu ekleyin. 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin, aspire edin ve 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542.
ile desteklenmiş 2 mL CDM ekleyin
not: CDM eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.
- İletilen ışığı ters çevrilmiş bir mikroskop altında, 4x büyütme kullanarak çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri nazikçe kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, hepsini 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 6 oyuklu ULA plakasının bir kuyucuğuna nazikçe aktarın. Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2.
ile inkübe edin
not: Koloniler çok büyükse veya birleşmişse, daha küçük EB'ler oluşturmak için çekilen cam pipetin ucuyla dilimlenebilirler.
- 2. günde, her bir kuyucuğa FGF2'yi 50 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
not: Serebellar farklılaşma için kullanılan FGF2 ısıya dayanıklı değildir. Bu protokol, ısıya dayanıklı FGF2 ile test edilmemiştir.
- 7. günde 1/3 orta düzeyde bir değişiklik yapın. 1.000 μL'lik bir pipetleyici ile bir kuyucukta 3 mL toplam ortam için, 1 mL kullanılmış ortamı nazikçe aspire edin ve 1 mL taze CDM ile değiştirin. EB'leri 7 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
- 14. günde, 1.000 μL'lik bir pipetleyici kullanarak neredeyse tüm kullanılmış ortamı nazikçe aspire edin. EB'lere minimum hasar vermek için, tüm EB'leri plakanın merkezinde toplamak için plakayı döndürün ve ardından plakayı eğin ve kenardan yavaşça aspire edin.
- Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yatırın ve aspire etmeye devam edin. EB'lerin kurumasını önlemek için yeterli ortam bırakın. Daha sonra, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL taze CDM ekleyin. EB'leri 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak FKÖ/laminin kaplı bir tabağa aktarın (adım 1.2).
not: Aşağı akış uygulamasına bağlı olarak, EB'ler 6 oyuklu bir FKÖ/laminin plakasına aktarılabilir veya tek EB'ler, FKÖ/laminin kaplı 24 oyuklu bir plakanın veya lamellerin tek bir kuyucuğuna aktarılabilir.
- 15. günde, ortamı aspire edin ve taze CDM ile değiştirin.
not: Zamanla buharlaşma olacağından, beslemeler arasında yeterli ortamı sağlamak için kuyucuklara yeterli ortam eklemek önemlidir (örneğin, 6 oyuklu bir plakadaki bir kuyu için 3 mL ortam ekleyin). Ortam asitleşmeye başladıysa (berrak ve sarıya dönerse), protokolün sonuna kadar besleme programında olmasa bile ortamı yenileyin.
- 21. günde, harcanan ortamı aspire edin ve CMM ile değiştirin. 28. günde, ortamı taze CMM ile değiştirin. 35. günde, daha sonraki uygulamalar için hücreleri hasat edin.
