1. Karışık Nöronlara ve Glia'ya HiPSC Farklılaşması
NOT: Prosedürün tamamlanması yaklaşık 28 gün sürer ve ana adımlar Şekil 1'de özetlenmiştir.
- Embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) oluşumu (0 → 1. günler)
NOT: Bu prosedür iyi manuel beceriler ve hassasiyet gerektirir. HiPSC (insan kaynaklı pluripotent kök hücreler) koloni fragmanları, sonraki adımlarda homojen embriyoid cisimler (EB'ler) elde etmek için eşit büyüklükte olmalıdır. Morfolojik olarak farklılaşmış koloniler (büyük sitoplazmik fraksiyonlar ve küçük nükleoller ile) atılmalıdır.
- Farklılaşmamış hiPSC kolonilerini (yaklaşık 1 mm çapında, bkz. Şekil 2A) kesmeden önce hiPSC ortamını (3 mL/60 mm Petri kabı) yenileyin.
- Farklılaşmamış kolonileri (Şekil 2A ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi) 30G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak yaklaşık 200 μm x 200 μm'lik parçalar halinde kesin. Oda sıcaklığında laminer akış kabininde 4X büyütmede stereoskopik mikroskop kullanın.
- Parçaları kaldırmak için altına hafifçe pipetleme ortamı ekleyerek 200 μL'lik bir pipet kullanarak koloni parçalarını tabak yüzeyinden ayırın.
- Tüm ayrılmış parçaları ve ortamı 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüm parçaları geri kazanmak için kabı 2 mL tam hiPSC besiyeri ile durulayın.
- 112 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve parçaları 5 mL tam hiPSC EB ortamında nazikçe yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Koloni parçalarını 60 mm'lik ultra düşük bağlantılı bir Petri kabına (5 mL/60 mm Petri kabı) koyun.
- Petri kabını gece boyunca 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin.
- Ertesi gün (1. Gün), EB'leri ve ortamlarını 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
- EB'leri 112 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve EB'leri 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 5 mL tam hiPSC EB ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
- EB'leri yeni bir 60 mm ultra düşük ataşmanlı Petri kabına (5 mL/60 mm Petri kabı) yeniden plakalayın.
- Petri kabını gece boyunca 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin.
- 1. Günde, bulaşıkları bazal membran matrisi (örneğin, matrigel, bundan sonra "standart matris" olarak anılacaktır) veya başka herhangi bir uygun protein substratı (örneğin, laminin) ile kaplayın.
- Standart matrisi (Malzeme Tablosuna bakın) -80 °C'de soğuk 1,5 mL tüpler ve soğuk 5 veya 10 mL pipetler kullanarak 200 μL'lik alikotlarda saklayın.
- 200 μL standart matrisi buz üzerinde çözdürün.
- 200 μL standart matrisi 20 mL bazal (DMEM / F12) ortamda (1:100 seyreltme) seyreltin.
- 60 mm'lik Petri kaplarını bu solüsyonla kaplayın (5 mL / tabak).
- Kaplanmış bulaşıkları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
not: Bu çanaklar, EB'leri (yaklaşık 50 EB / tabak) kaplamak ve nöroepitelyal agregatlar (rozetler) oluşturmak için kullanılacaktır; Adım 1.3'e bakın.
- Nöroepitelyal agregatların (rozetler) oluşumu (2. → 7. günler)
- 2. Günde, standart matris kaplama solüsyonunu 60 mm'lik Petri kaplarından çıkarın (plakaları durulamaya gerek yoktur) ve bunları 5 mL / tabak tam nöroepitelyal indüksiyon ortamı (NRI) ile doldurun; Malzeme Tablosuna bakınız.
- Yüzen EB'leri (adım 1.1.14'ten itibaren) 200 μL'lik bir pipet kullanarak stereoskopik mikroskop altında 4x büyütmede kaplanmış kaplara (~ 50 EB / tabak) aktarın ve laminer bir akış kabinine yerleştirin.
not: Homojen, orta büyüklükte EB'lerin (~200-300 μm çapında) seçilmesi çok önemlidir. Çok küçük EB'ler nöroektodermal farklılaşma sırasında iyi hayatta kalamayabilirken, çok büyük EB'ler çekirdek nekrozuna uğrama eğilimindedir.
- Bulaşıkları 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin.
- Ertesi gün (3. gün), EB'lerin hepsinin bağlı olduğundan emin olmak için bulaşıkları mikroskop altında 10x büyütmede kontrol edin.
- Eksiksiz bir NRI ortamı ile nazikçe toplam ortam değişikliği gerçekleştirin.
- NRI ortamını, nöroepitelyal agregatların (rozetler) görünür olması gereken 7. güne kadar her gün değiştirin.
- 7. Günde, adım 1.2'de açıklandığı gibi standart matrisi (veya laminini) gerekli herhangi bir plaka veya tabak formatına kaplayın: 96 oyuklu plakalar (100 μL/oyuk), 24 oyuklu plakalar (250 μL/oyuk), 12 oyuklu plakalar (500 μL/oyuk), MEA çipleri (elektriksel aktivite için, 1 mL/tek oyuklu çip) veya 60 mm Petri kapları (4 mL/tabak).
- Kaplanmış plakaları/tabakları 37 °C ve %5 CO2'de en az 2 saat inkübe edin.
- Rozet ayrışması ve nöronal farklılaşma (8. → 28. günler)
NOT: Bu prosedür iyi manuel beceriler ve hassasiyet gerektirir. Mezodermal ve endodermal hücrelerin toplanmasını önlemek için, sadece ektoderm rozet benzeri yapılar ayrıştırılmalı ve toplanmalıdır.
- 8. Günde, rozet benzeri yapıları steril koşullarda 10X büyütmede stereoskopik mikroskop altında parçalara ayırın. 30G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanın. Rozetlerin iğne ile kolayca dokunulduğunda tabaktan ayrılma eğiliminde olduğunu unutmayın.
- 200 μL'lik bir pipet kullanarak rozet parçalarının ayrılmasını tamamlayın.
- Çanağı laminer akış başlığının altına aktarın ve rozet parçalarını ve ortamlarını 1, 2 veya 5 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Tüm parçaları geri kazanmak için kabı 2 mL NRI ortamı ile durulayın.
- Rozet parçalarını 112 x g'da 2 dakika döndürün.
- Süpernatanı aspire edin.
- Peleti 1 mL 1x DPBS'de (kalsiyum ve magnezyum olmadan) nazikçe yeniden süspanse edin ve rozet parçalarını kısmen ayırmak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- 4 mL tam NRI ortamı ekleyin ve tripan mavisi ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın (Malzeme Tablosuna bakınız)
not: 20 μL hücre süspansiyonunu 20 μL Tripan mavisi ile seyreltin. Hücreler tek hücreli bir süspansiyona getirilemezse bu adım atlanabilir. Rozet parçaları tamamen ayrışmış görünmüyorsa, yaklaşık 50 EBs/60 mm'lik çanaktan türetilen rozet parçaları, Tablo 1'de gösterildiği gibi 50 mL tam NRI ortamında yeniden süspanse edilebilir ve kaplanabilir.
- Petri kaplarından, plakalardan ve/veya MEA çiplerinden standart matris (veya laminin) kaplama solüsyonunu aspire edin (adım 1.3.7'den itibaren). Kurumasına izin vermeyin.
- Hücreleri çalışma planına göre tam bir NRI ortamında plakalayın (yaklaşık 15.000 hücre /cm2; kaplama hacmi göstergeleri için Tablo 1'e bakınız).
- Plakaları gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 10. Günde, tam bir nöronal farklılaşma ortamı (ND) kullanarak toplam ortam değişikliği gerçekleştirin; Malzeme Tablosuna bakınız.
- 28. güne kadar tüm ND ortamını haftada iki kez yenileyin.
Tablo 1.
Ayrışmış rozet kaplama yoğunluğu hakkında not: rozet parçaları tamamen ayrışmış görünmüyorsa, yaklaşık 15.000 hücre/cm2'lik bir hücre kaplama yoğunluğuna ulaşmak için, yaklaşık 50 EBs/1 x 60 mm'lik çanaktan türetilen ayrışmış rozet parçaları, 50 mL tam NRI ortamında yeniden süspanse edilebilir ve aşağıdaki gibi kaplanabilir (plaka formatına bağlı olarak):
| Çok kuyulu plakalar / MEA | Büyüme alanı (cm2/kuyu) | Hücre süspansiyonunun kuyucuk başına plakaya (veya MEA çipine) hacmi | Kaplanabilecek maksimum plaka sayısı (50 ml hücre süspansiyonu ile) |
| 96 kuyu | 0,3 | 100 ul | 5 |
| 48 kuyu | 0,7 | 220 ul | 4 |
| 24 kuyu | 2 | 625 ul | 3 |
| 12 kuyu | 4 | 1,25 ml | 3 |
| 6 kuyu | 10 | 3.125 ml | 2 |
| Tek kuyulu MEA çipi | 3.5 | 1,1 ml | 45 |
