Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Ventral Orta Beyin Hücrelerinin Ayrışması
- Ventral orta beynin parçalarını laminer bir akış başlığı altına aktarın. Hanks'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) çıkarın ve 1 ml önceden ısıtılmış (37 ºC) %0.05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (tripsin-EDTA) konik tüpe ekleyin (12 parçaya kadar ventral orta beyin için yeterli hacimler). Dokuyu 37 ºC'de 5-10 dakika inkübe edin.
- Kaputun altındaki tripsin-EDTA'yı çıkarın ve dokuya 1 ml deaktivasyon ortamı (serum tripsini etkisiz hale getirecektir) ekleyin.
- Deaktivasyon ortamını çıkarın ve dokuyu tam ortamın 1 ml'sinde iki kez yıkayın.
not: Ayrışmış hücrelerin atılmasını önlemek için, tüm ortamı tüpten çıkarmaktan ve dokuyu pipetlemekten kaçının.
- 1 ml tam besiyeri ekleyin ve dokuyu ateşle parlatılmış bir cam pipetle ezin. Kabarcık oluşumundan kaçının ve tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar ezmeye devam edin.
NOT: Genellikle, tam ayrışma için kısıtlı uçtan 8-10 geçiş gereklidir.
- Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve ortamı çıkarın.
- Dört defaya kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti 1 ml'lik tam ortamda yeniden süspanse edin.
2. Ventral Orta Beyin Hücrelerinin Kaplanması
- 10 μl hücre süspansiyonunu 90 μl Tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın ve bir hemositometre ile hücre sayısını sayın.
not: Hücrelerin canlılığı da bu aşamada kontrol edilebilir.
- Sterilize edilmiş mikrosantrifüj tüp kapaklarını 100 mm'lik Petri kaplarına yerleştirin ve Poli-L-ornitin/Laminin kaplı lamelleri forseps kullanarak kapakların üzerine birer birer aktarın.
not: Lamelleri yıkamayın ve laminini kurutmaktan kaçının, çünkü bu düzensiz kültürlere neden olabilir ve hücrelerin hayatta kalma kabiliyetini azaltabilir.
- Her lamel üzerine tam bir ortam ve 100 μl (toplam 150.000 hücre) hücre süspansiyonu ekleyerek hacmi 1 μl başına 1.500 hücre olarak ayarlayın (hacim, lamel yüzeyini dökülmeden kaplamak için en uygunudur). Petri kaplarını kapatın ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C, %5 CO2) 1 saat inkübe edin.
not: KRİTİK ADIM: Bu adım, hücrelerin tutunmasını ve canlılığını arttırmak ve embriyo başına lamel sayısını artırmak için gereklidir. Alternatif olarak, hücreler doğrudan kuyucuklara (lameller içeren) aktarılabilir, ancak hücre sayısı kuyu başına 350.000'e çıkarılmalıdır (150.000 yerine). Başka bir deyişle, bu yöntem kullanılarak 8-10 lamel elde edilebilirken, doğrudan transfer, plakalara yapışan hücreler (lamellerin yanında veya altında) nedeniyle yaklaşık 3-4 lamel verir. Bu yöntemi kullanan kültürlerin ortalama canlılığı %90 civarındaydı.
3. Kültür Büyümesi ve Bakımı
- 1 saatlik inkübasyondan sonra, ortam da dahil olmak üzere lamelleri, 400 μl önceden ısıtılmış (37 ºC'ye) tam ortam (toplam hacim: 500 μl) içeren 24 oyuklu plakalara dikkatlice aktarın. Hücreleri gece boyunca (O / N) 37 ºC'de inkübe edin.
- Kuyucukların inkübe edilmesinden sonraki 24 saat içinde, her bir oyuğa nazikçe 500 μl tam ortam ekleyin.
NOT: İlk birkaç saat, dopaminerjik nöronların hayatta kalması için en kritik aşamadır ve hayatta kalan hücrelerin sayısı bu noktadan sonra önemli ölçüde değişmez.
- İlk iki hafta boyunca veya ortam sarı olana kadar kültürlere ek besiyeri eklemeyin. İki haftadan daha uzun süre kültürlenirse veya orta renk sarıya dönerse, ortamın yarısını (500 μl) taze, eksiksiz önceden ısıtılmış ortamla (tipik olarak her iki haftada bir) değiştirin.
not: Kültürlerdeki dopaminerjik nöronlar, bu koşullar altında altı haftadan fazla hayatta kalacaktır.
