İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Doku Örneklerinin Alınması
NOT: Bu protokolün kritik bir bileşeni, otopsi anından hemen başlayarak doku bağışının uygun şekilde ele alınmasını gerektirir. Numunenin genel canlılığı, önemli ölçüde Ölüm Sonrası Aralığın (PMI) en aza indirilmesine, dokunun hemen antibiyotik/antimikotiklerle desteklenmiş uygun soğuk ortama aktarılmasına, numunenin taşıma boyunca ıslak buz üzerinde tutulmasına ve protokol boyunca steril tekniğin korunmasına bağlıdır.
- Yaklaşan bir bağışın bildirilmesi üzerine, bir numune toplama kiti hazırlayın. Doku numunesinin doğrudan iade nakliyesi için kullanılabilecek yalıtımlı bir konteynere sahip bir nakliye kutusu kullanarak, aşağıdaki malzemeleri ekleyin:
- Steril eldivenler, örtüler ve neşterler dahil olmak üzere steril hazırlık için malzemeler ekleyin.
- 30 mL nakliye ortamı içeren 8 - 10 steril 50 mL konik tüpleri, buzlu veya soğuk paketlerle yalıtımlı kaba dahil edin.
not: Herhangi bir standart hücre kültürü ortamı işe yarayabilirken, en iyi numune canlılığı antibiyotik/antimikotik ile desteklenmiş Hibernate-A ile elde edilir.
- Diğer analizler için başka numune tüplerini dahil edin (örn., fiksatifler).
- Otopsi araştırmacının yerinde yapılmayacaksa, tümör örneğinin nasıl alınacağını açıkça belirten bir belge ekleyin. Bu, sterilitenin korunması, numune tüplerinin ıslak buz üzerinde tutulması ve tümör hücrelerinin sıklıkla bu bölgeleri istila etmesi nedeniyle orta beyin ve medulladan alınan numunelerin dahil edilmesi gibi ayrıntıları içerir.
- Otopsi sırasında steriliteyi koruyun. Kafatası içindeki beyni steril olarak düşünün, bu nedenle kafatası açıldıktan sonra steril tekniği (eldiven değiştirmek dahil) gözlemleyin. Cilt ve saç ile kontaminasyondan kaçınmak çok önemlidir.
- Tümörü ventral taraftan diseksiyon (ponsun "göbeği", bkz. Şekil 1). Steril bir neşter ile tümörden 1 cm'lik küçük parçalar kesin ve hemen soğuk nakliye ortamına aktarın (adım 1.1.2'deki NOT'a bakın) ve ıslak buz üzerine koyun. Her tüpe 10 mL doku yerleştirin, bu da her tüpte 40 mL'lik nihai bir doku ve ortam hacmi ile sonuçlanır.
not: Diffüz intrinsik pons gliomu (DIPG) durumunda, tümör yaygın olarak ponsa ve sıklıkla beyin sapının geri kalanına sızar. Bu nedenle, tipik olarak ponstan 3-4 tüp (30-40 mL doku) ve orta beyin ve medulladan her biri 1-2 tüp (10-20 mL doku) dahil olmak üzere mümkün olduğunca çok numune toplayın.
- Orta beyin ve medulladan, genellikle birçok tümör hücresi içeren pons ile yan yana örnekler toplayın.
- Numune alındıktan sonra, numuneleri gece boyunca (O/H) yalıtımlı kapta ıslak buz üzerinde gönderin. Numuneyi kuru buz üzerinde göndermeyin, çünkü donma hücreleri öldürür.
2. Numune İşleme için Hazırlık
- Numune hazırlamaya başlamadan önce, doku kültürü başlıklarını tıraş bıçakları, kavisli kanama durdurucular ve diğer steril olmayan aletlerle birlikte ultraviyole (UV) ışık altında 1 saat sterilize edin. Kültürlerin kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki adımların tümünü steril koşullar altında gerçekleştirin.
- Filtre çözeltilerini hazırlayın ve steril hale getirin.
- 1.8 M sükroz çözeltisi hazırlamak için 308.07 g sükrozu 300 mL damıtılmış suda çözün. Kalsiyum veya magnezyum içermeyen 50 mL 10x Hank's tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi (HBSS) ekleyin ve damıtılmış su kullanarak toplam hacmi 500 mL'ye getirin. 4 °C'de saklayın.
- Enzimatik sindirim çözeltisi hazırlamak için, her 10 mL kıyma dokusu için kalsiyum ve magnezyum ile 50 mL HBSS alın ve 500 μL 5 mg / mL deoksiribonükleaz I (son konsantrasyon 50 μg / mL), 500 μL 2.5 mg / mL kollajenaz I / II ekleyin ve çözeltiyi boşaltın (son konsantrasyon 25 μg / mL), ve 500 μL 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tamponu. 37 ° C'lik bir su banyosunda ön ısıtma sindirim çözeltisi.
- Tümör kök besiyeri (TSM) bazını hazırlamak için 250 mL Neurobazal-A, 250 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu karıştırın: Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), 5 mL 100x antibiyotik-antimikotik, 5 mL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid (GlutaMAX-A), 5 mL HEPES tamponu, 5 mL 100 mM sodyum piruvat ve 5 mL 100x MEM esansiyel olmayan amino asitler.
- Büyüme faktörleri ile tam TSM hazırlamak için, TSM bazına aşağıdaki takviyeleri ekleyin: 50x B27 Takviyesi Eksi A Vitamini (1:50), insan Epidermal Büyüme Faktörü (H-EGF, 20 ng/mL), insan Fibroblast Büyüme Faktörü (H-FGF, 20 ng/mL), insan Trombosit kaynaklı Büyüme Faktörü AA (H-PDGF-AA, 10 ng/mL), insan Trombosit kaynaklı Büyüme Faktörü BB (H-PDGF-BB, 10 ng/mL) ve heparin çözeltisi (2 μg/mL).
- Döner kova rotoru ile donatılmış bir laboratuvar santrifüjünü 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
3. Mekanik Ayrışma
- Dokuyu yüksek duvarlı 100 mm x 20 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın. Nakliyeden arta kalan medyayı çıkarın ve 10 - 15 mL soğuk kültür medyası ile değiştirin.
- Bir tıraş bıçağını kavramak için kavisli kanama durdurucuları kullanarak, belirgin kan damarlarını veya meninksleri çıkarırken dokuyu ince bir şekilde kıyın.
not: Son doku fragmanları 1 mm'den küçük olmalıdır (bkz. Şekil 2B).
- Dokuyu 50 mL'lik temiz bir konik tüpe aktarın. Hücre kültürü kabını ilave 5 mL soğuk kültür ortamı ile yıkayın ve konik tüpe aktarın. Kalan dokuyu aktarmak için bu yıkama adımını gerektiği kadar tekrarlayın.
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak hafifçe ezin (4-5 kez). Daha büyük doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Gerekirse, numuneyi 1 dakika (350 x g, 4 °C) kısaca santrifüjleyin.
- Mekanik olarak ayrışmış fraksiyonu toplayın.
- Süpernatanı çıkarın ve 100 μm'lik bir filtreden "Mekanik Ayrışma" etiketli yeni bir 50 mL konik tüpe süzün. Filtreyi orijinal konik tüpün üzerine ters çevirin ve doku parçalarını geri kazanmak için kültür ortamıyla yıkayın.
- "Mekanik Ayrışma" fraksiyonunu 5 dakika (350 x g, 4 °C) santrifüjleyin.
- Süpernatanı peletlenmiş "Mekanik Ayrışma" fraksiyonundan çıkarın ve dokuyu soğuk kültür ortamında yeniden süspanse edin. "Mekanik Ayrışma" konik tüpünde 5 mL'den fazla doku varsa, dokuyu hiçbir tüpte 5 mL'den fazla doku olmayacak şekilde diğer 50 mL'lik konik tüplere bölün.
- Mekanik olarak ayrışmış fraksiyonu, sakaroz gradyan santrifüjleme adımına kadar buz üzerinde saklayın (Adım 5). Alternatif olarak, mekanik olarak ayrışan fraksiyon, enzimatik ayrışma inkübasyon periyodu sırasında Adım 5'e geçebilir (Adım 4.4).
4. Enzimatik Ayrışma
- Kalan daha büyük doku parçalarını içeren tüpte 5 mL'den fazla doku varsa, dokuyu hiçbir tüpte 5 mL'den fazla doku olmayacak şekilde diğer yeni 50 mL konik tüplere bölün.
- Kalan doku parçalarını içeren konik tüp(ler)i 5 dakika (350 x g, 4 °C) santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve önceden ısıtılmış enzimatik sindirim solüsyonunu ekleyin, böylece her 1 mL doku için 5 mL sindirim solüsyonu (ör., 5 mL doku için 25 mL sindirim solüsyonu).
- Konik tüp kapaklarını laboratuvar filmi ile kapatın ve reaksiyonu 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, numuneleri nazikçe ezin (bkz. Şekil 2C).
- 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, numuneyi 6-8 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Aşırı hava kabarcığı oluşturmaktan kaçının.
- Pipetin ucuna 1.000 μL'lik bir pipet ucu ekleyin ve 6-8 kez daha ezin.
- Kalan parçaların tüpün dibine çökmesine izin verin. Süpernatanı, hücreler hala 100 μm'lik bir filtreden "Enzimatik Ayrışma" etiketli yeni bir 50 mL konik tüpe asılı olarak çıkarın ve süzün ve buz üzerinde saklayın.
- Önemli doku parçaları kalırsa, parçalara kalsiyum ve magnezyum içeren 10 mL HBSS ekleyin ve 3.5.1 ve 3.5.2 adımlarını tekrarlayın. Bu son çözeltiyi 100 μm'lik bir filtreden "Enzimatik Ayrışma" tüpüne süzün.
- "Enzimatik Ayrışma" tüpünü 5 dakika (350 x g, 4 °C) santrifüjleyin ve sükroz gradyan santrifüjlemeye devam edin.
5. Sükroz Gradyan Santrifüjleme
- Numuneler hala çözelti içinde süspanse edilmişse, 5 dakika (350 x g, 4 °C) santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve dokuyu kalsiyum ve magnezyum içermeyen 20 mL soğuk HBSS'de yeniden süspanse edin. Soğuk HBSS ile toplam 25 mL'ye kadar hacim getirin.
- Yavaşça 25 mL 1.8 M sükroz çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Bu, 0.9 M sükroz gradyanı ile sonuçlanır.
- Frensiz olarak 10 dakika (800 x g, 4 °C) santrifüjleyin. Bir santrifüj freni kullanmak gradyanı bozacak ve verimi azaltacaktır (santrifüjlemeden önce ve sonra bir numune örneği için Şekil 2D'ye bakın).
- Miyelin kalıntılarını ve mümkün olduğunca fazla sükroz çözeltisini dikkatlice aspire edin. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mL soğuk HBSS ekleyerek ve hafifçe karıştırarak numuneyi yıkayın. 5 dakika santrifüjleyin (350 x g, 4 °C).
6. ACK Kırmızı Kan Hücresi Lizisi
- Yıkama süpernatantını çıkarın. 5 mL ACK lizis tamponu ekleyin ve tüp peletini RT'de 1 dakika döndürerek hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin.
- Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mL soğuk HBSS ekleyerek lizisi söndürün.
- 5 dakika santrifüjleyin (350 x g, 4 °C).
7. İlk Kültür Bakımı
- Son hücre peletlerini 10-15 mL'lik sıcak tam TSM'de büyüme faktörleri ile yeniden süspanse edin ve tripan mavisi dışlaması kullanarak bir hemositometör üzerinde canlı hücre yoğunluğunu ölçün.
not: Canlı hücrelerin aralığı, doku bağışının koşullarına bağlı olarak büyük ölçüde değişir ve artık hücresel kalıntılar nedeniyle bu erken aşamada miktar tayini zor olabilir. İdeal bir durumda, numune başına bir milyon canlı hücreye sahip olmayı hedefleyin. Aşırı döküntü kaldığı durumlarda, bir T175 şişesinde daha düşük bir yoğunlukta plaka.
- Son hücre süspansiyonlarını yeni bir T75 kültür şişesine aktarın. Genel büyüme faktörü seviyelerini korumak ve tümör hücresi nörosferlerinin gelişimini izlemek için her gün ek büyüme faktörlerinde ani artış (bkz. Şekil 2E ve Şekil 3).
