Omurilik Nöral Progenitör Hücrelerinin Motor Nöronlara Farklılaşması

Özet

Kaynak: Taga, A. et al., Bölgeye Özgü İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla ALS'yi Modellemek İçin Elektrofizyolojik Bir Platform Kurulması. J. Vis. Exp. (2021).

Bu videoda, omurilik nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) motor nöronlara ayırmak için bir yöntem gösterilmektedir. NPC'lerin olgun motor nöronlara farklılaşmasını kolaylaştırmayı amaçlayan spesifik inhibitörlerle zenginleştirilmiş özel ortam kullanılarak kaplanmış bir kültür plakası üzerinde NPC'lerin kültürleme sürecini detaylandırır.

Protokol

1. Nöral Progenitör Hücrelerin (NPC) kültürlerinin çözülmesi

1. Hücrelerin çözülmesinden bir gün önce 10 cm'lik plakaları poliornitin (PLO) ve laminin ile kaplayın.
   1. Plakalara fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) veya damıtılmış su (dH₂O) içinde 100 μg / mL'ye seyreltilmiş 5 mL PLO ekleyin. 37 °C'de en az 1 saat ila gece boyunca inkübe edin.
   2. FKÖ solüsyonunu aspire edin ve plakaları PBS ile üç kez durulayın. (FKÖ uygun şekilde yıkanmazsa toksiktir.)
   3. PLO kaplı plakalara PBS içinde 10 μg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltilmiş laminin ekleyin. 37 °C'de en az 1 saat, tercihen gece boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücre yapışmasını arttırmak için laminin çözeltisini durulamadan aspire edin.
      not: Plakalar önceden FKÖ ile kaplanabilir, üç kez su ile yıkanabilir, steril bir kapüşonda kurutulabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
2. Her 10 cm hücre kültürü plakası için 6 x 10⁶ hücre / flakon içeren bir NPC şişesini çözün.
3. NPC kriyotüpünü sıvı nitrojenden çıkarın ve hemen 37 °C'lik bir su banyosuna 2 dakikaya kadar yerleştirin. Sıvı ile çevrili küçük bir buz parçası olana kadar şişeyi sallayarak hızla çözdürün.
4. Hücre agregalarını 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve dimetil sülfoksiti (DMSO) seyreltmek için 15 mL'ye kadar önceden ısıtılmış Nöral farklılaşma ortamı (NDM) veya Dulbecco'nun Modifiye Eagles Ortamı (DMEM) / Ham'ın F21 F12 takviyesi ekleyin.
5. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini motor nöron (MN) farklılaşma ortamı (Tablo 1) + ROCK-I (20 μM) ile yeniden süspanse edin ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar (5 kata kadar) yukarı ve aşağı tritüre etmek için 1000 μL'lik bir pipet kullanın.
7. Tek hücreli süspansiyonu PLO-Laminin kaplı 10 cm'lik bir plakaya aktarın.
8. Plakayı bir inkübatöre aktarın ve uygun hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca rahatsız edilmeden bırakın

2. Omurilik NPC'sini motor nöronlara ayırma

1. Adım 1.1-1.8'de belirtildiği gibi ilk adımları gerçekleştirin, son ortam MN farklılaşma ortamı + ROCK-I (20 μM) olacaktır.
2. Kaplamadan sonraki gün, ROCK-I olmadan MN farklılaşma ortamı ile ortamın tam bir değişimini gerçekleştirin ve ardından ortamı her gün değiştirin. Hafta sonu boyunca, hücreleri Cuma günü ve ardından Pazartesi günü tekrar besleyin. Hücre kalıntılarını temizlemek için gerektiğinde hücreleri PBS ile durulayın.
3. Ortamı MN farklılaşma ortamı + sitozin arabinozit (ARA-C) (0.02 μM) ile değiştirin ve glial taahhütlü progenitörler, hücre kümelerinde toplanan mitotik sonrası MN progenitörleri altında tek proliferatif düz hücreler olarak ortaya çıktığında 48 saat inkübe edin.
   not: Genellikle bu, ilk kaplamadan sonraki ilk 7 gün içinde gerçekleşir, ancak hücre hattına bağlı olarak değişkenlik olabilir.
4. 48 saat sonra, ARA-C içeren besiyerini aspire edin, kültürleri PBS ile üç kez nazikçe durulayın ve besiyerini ARA-C içermeyen taze MN besiyerine değiştirin.
5. ARA-C ile tedaviden sonra, nöronal kümelerin erken ayrılmasını önlemek için eski ortamı vakum aspiratörü yerine manuel bir pipetle çıkararak her gün (veya Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) ortam değişimleri gerçekleştirin. Ek olarak, kültür plakalarına nöronal bağlanmayı daha da artırmak için MN ortamını haftada bir kez Laminin 1 μg / mL ile zenginleştirin.

Tablo 1: Kültür Ortamı

Orta ad	Reaktif	Konsantrasyon
Nöral farklılaşma ortamı (NDM)	Nörobazal L-Glutamin Esansiyel Olmayan Amino Asitler Ek N - N2 Ek Penisilin / streptomisin	1x 100x 100x 100x 100 katı
Motor nöron farklılaşma ortamı	Nöral farklılaşma ortamı Askorbik asit Puromorfamin Beyin kaynaklı nörotrofik faktör Siliyer nörotrofik faktör İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör Retinoik asit Bileşik E Ek B - B27 Takviyesi	1x 0,4 μg/mL 1 μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50 katı

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm steril kültür plakaları	doğan	353003
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)	Termo Balıkçı	11140050	Çalışma konsantrasyonu 100x
Ek N - N2 Eki	Termo Balıkçı	17502048	Çalışma konsantrasyonu 100x
L-Glutamin	Termo Balıkçı	25030	Çalışma konsantrasyonu 100x
Nörobazal	Termo Balıkçı	21103049	Çalışma konsantrasyonu 1x
Retinoik asit (RA)	Sigma	R2625 Serisi	100 mM stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 3.3 mL DMSO'ya çözün. Stoku 100 μL/tüp ayırın ve -80 ºC'de dondurun. 200 μL 100 mM stok alın ve 10 mM stok yapmak için 10x seyreltin (1.8 mL DMSO ekleyin). Aliquot 50 μL / tüp ve -80 ºC'de saklayın. Kullanım için 1:10000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 2 μM).
Poliornitin (FKÖ)	Sigma-Aldrich	P3655 Serisi	100 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 1 mL ddW'de çözün. Stoku 100 μL'lik tüplerde alikot edin. (çalışma konsantrasyonu 100 μg/mL)
Laminin	Termo Balıkçı	23017-015	Stok çözeltisi 1 mg/mL, çalışma konsantrasyonu 10 μg/mL (kaplama), 1 μg/mL (hücre ortamı)
Askorbik asit (ASAC)	Sigma	A4403	0.4 mg / ml stok elde etmek için 100 mg'ı 250 mL dH2O'ya çözün. 0.22 μm'lik bir filtreden steril filtre, alikot ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 0.4 μg/mL).
Siliyer nörotrofik faktör (CNTF)	Peprotech teknolojisi	450-13	100 μg'yi 1 mL steril PBS'de çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Bileşik E	Abcam Belediyesi	ab142164	250 μM'lik bir stok elde etmek için 250 μg'yi 2.0387 mL DMSO'da çözün. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:2000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 125 nM).
DMEM/F12	Termo Balıkçı	113300	Çalışma konsantrasyonu 1x
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF)	Peprotech teknolojisi	450-10	100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
ROCK-I engelleyici	Peprotech teknolojisi	1293823	10 mM stok elde etmek için 5 mg'ı 1480 μL dH2O'da çözün, alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 500 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 μM).
Pencillin/Streptomisin	Termo Balıkçı	15140122	Çalışma konsantrasyonu 100x
Purmorfamin (PMN)	Millipore-Sigma	540223	1 mM çözelti elde etmek için 5 mg'ı 9.6 mL DMSO'da çözün. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 1 μM).
Rekombinant insan-beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)	Peprotech teknolojisi	450-02	Sulandırmadan önce kısa bir süre santrifüjleyin. 100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1)	Ar-Ge sistemleri	291-G1-200	200 μg'yi 2 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün, ardından 10 μg/mL stok yapmak için 18 mL %0.1 BSA-PBS ekleyin ve -80 ºC'de saklayın. Kullanım için 10 μg/mL stoğu 1: 1000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF)	Peprotech teknolojisi	450-10	100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Retinoik asit (RA)	Sigma	R2625 Serisi	100 mM stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 3.3 mL DMSO'ya çözün. Stoku 100 μL/tüp ayırın ve -80 ºC'de dondurun. 200 μL 100 mM stok alın ve 10 mM stok yapmak için 10x seyreltin (1.8 mL DMSO ekleyin). Aliquot 50 μL / tüp ve -80 ºC'de saklayın. Kullanım için 1:10000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 2 μM).
Bileşik E	Abcam Belediyesi	ab142164	250 μM'lik bir stok elde etmek için 250 μg'yi 2.0387 mL DMSO'da çözün. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:2000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 125 nM).
Ek B - B27 Takviyesi	Termo Balıkçı	21985023	Çalışma konsantrasyonu 50x
Steril hücre kültürü davlumbazları	Fırıncı Şirketi	SG-600
Masa üstü hücre kültürü santrifüjü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	75004261	Sorvall Efsanesi X1R
Su banyosu	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	2332	Isotemp (Isotemp
Nem kontrollü Hücre kültürü inkübatörü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	370	37 ºC'ye, %5 CO2'ye ayarlandığında

Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi ) adet