Omurilik Nöral Progenitör Hücrelerinin Motor Nöronlara Farklılaşması

Özet

Kaynak: Taga, A. et al., Bölgeye Özgü İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla ALS'yi Modellemek İçin Elektrofizyolojik Bir Platform Kurulması. J. Vis. Exp. (2021).

Bu videoda, omurilik nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) motor nöronlara ayırmak için bir yöntem gösterilmektedir. NPC'lerin olgun motor nöronlara farklılaşmasını kolaylaştırmayı amaçlayan spesifik inhibitörlerle zenginleştirilmiş özel ortam kullanılarak kaplanmış bir kültür plakası üzerinde NPC'lerin kültürleme sürecini detaylandırır.

Protokol

1. Nöral Progenitör Hücrelerin (NPC) kültürlerinin çözülmesi

1. Hücrelerin çözülmesinden bir gün önce 10 cm'lik plakaları poliornitin (PLO) ve laminin ile kaplayın.
   1. Plakalara fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) veya damıtılmış su (dH₂O) içinde 100 μg / mL'ye seyreltilmiş 5 mL PLO ekleyin. 37 °C'de en az 1 saat ila gece boyunca inkübe edin.
   2. FKÖ solüsyonunu aspire edin ve plakaları PBS ile üç kez durulayın. (FKÖ uygun şekilde yıkanmazsa toksiktir.)
   3. PLO kaplı plakalara PBS içinde 10 μg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltilmiş laminin ekleyin. 37 °C'de en az 1 saat, tercihen gece boyunca inkübe edin. İnküba....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm steril kültür plakaları	doğan	353003
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)	Termo Balıkçı	11140050	Çalışma konsantrasyonu 100x
Ek N - N2 Eki	Termo Balıkçı	17502048	Çalışma konsantrasyonu 100x
L-Glutamin	Termo Balıkçı	25030	Çalışma konsantrasyonu 100x
Nörobazal	Termo Balıkçı	21103049	Çalışma konsantrasyonu 1x
Retinoik asit (RA)	Sigma	R2625 Serisi	100 mM stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 3.3 mL DMSO'ya çözün. Stoku 100 μL/tüp ayırın ve -80 ºC'de dondurun. 200 μL 100 mM stok alın ve 10 mM stok yapmak için 10x seyreltin (1.8 mL DMSO ekleyin). Aliquot 50 μL / tüp ve -80 ºC'de saklayın. Kullanım için 1:10000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 2 μM).
Poliornitin (FKÖ)	Sigma-Aldrich	P3655 Serisi	100 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 1 mL ddW'de çözün. Stoku 100 μL'lik tüplerde alikot edin. (çalışma konsantrasyonu 100 μg/mL)
Laminin	Termo Balıkçı	23017-015	Stok çözeltisi 1 mg/mL, çalışma konsantrasyonu 10 μg/mL (kaplama), 1 μg/mL (hücre ortamı)
Askorbik asit (ASAC)	Sigma	A4403	0.4 mg / ml stok elde etmek için 100 mg'ı 250 mL dH2O'ya çözün. 0.22 μm'lik bir filtreden steril filtre, alikot ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 0.4 μg/mL).
Siliyer nörotrofik faktör (CNTF)	Peprotech teknolojisi	450-13	100 μg'yi 1 mL steril PBS'de çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Bileşik E	Abcam Belediyesi	ab142164	250 μM'lik bir stok elde etmek için 250 μg'yi 2.0387 mL DMSO'da çözün. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:2000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 125 nM).
DMEM/F12	Termo Balıkçı	113300	Çalışma konsantrasyonu 1x
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF)	Peprotech teknolojisi	450-10	100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
ROCK-I engelleyici	Peprotech teknolojisi	1293823	10 mM stok elde etmek için 5 mg'ı 1480 μL dH2O'da çözün, alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 500 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 μM).
Pencillin/Streptomisin	Termo Balıkçı	15140122	Çalışma konsantrasyonu 100x
Purmorfamin (PMN)	Millipore-Sigma	540223	1 mM çözelti elde etmek için 5 mg'ı 9.6 mL DMSO'da çözün. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 1 μM).
Rekombinant insan-beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)	Peprotech teknolojisi	450-02	Sulandırmadan önce kısa bir süre santrifüjleyin. 100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1)	Ar-Ge sistemleri	291-G1-200	200 μg'yi 2 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün, ardından 10 μg/mL stok yapmak için 18 mL %0.1 BSA-PBS ekleyin ve -80 ºC'de saklayın. Kullanım için 10 μg/mL stoğu 1: 1000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF)	Peprotech teknolojisi	450-10	100 μg'yi 1 mL PBS'de 100 μg/mL'ye çözün ve ardından 10 μg/mL'ye 9 mL steril %0.1 BSA-PBS ekleyin. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Retinoik asit (RA)	Sigma	R2625 Serisi	100 mM stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 3.3 mL DMSO'ya çözün. Stoku 100 μL/tüp ayırın ve -80 ºC'de dondurun. 200 μL 100 mM stok alın ve 10 mM stok yapmak için 10x seyreltin (1.8 mL DMSO ekleyin). Aliquot 50 μL / tüp ve -80 ºC'de saklayın. Kullanım için 1:10000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 2 μM).
Bileşik E	Abcam Belediyesi	ab142164	250 μM'lik bir stok elde etmek için 250 μg'yi 2.0387 mL DMSO'da çözün. Alikot edin ve -80 ºC'de dondurun. Kullanım için 1:2000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 125 nM).
Ek B - B27 Takviyesi	Termo Balıkçı	21985023	Çalışma konsantrasyonu 50x
Steril hücre kültürü davlumbazları	Fırıncı Şirketi	SG-600
Masa üstü hücre kültürü santrifüjü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	75004261	Sorvall Efsanesi X1R
Su banyosu	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	2332	Isotemp (Isotemp
Nem kontrollü Hücre kültürü inkübatörü	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	370	37 ºC'ye, %5 CO2'ye ayarlandığında

Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi ) adet