Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlıklar
- CGNP (serebellar granüler nöron progenitör) izolasyonu için hazırlıklar
- Beyincik'i izole etmek için P5-P7 hayvanları oluşturmak için uygun bir fare çiftleşmesi düzenleyin (ChIP ve durum başına 3-5 hayvan).
- HBSS tamponuna 6 mg / mL glikoz ekleyerek HBSS / Glikoz hazırlayın.
- DMEM-F12'ye %1 (h/h) N2 takviyesi, %1 (h/h) Penisilin-Streptomisin-Neomisin, 25 mM KCl ve %10 FCS ekleyerek CGNP hücre kültürü ortamını (CGM) hazırlayın. CGNP yetiştiriciliği için, FCS içermeyen ancak 0,6 μg/mL sonik kirpi (SHH) (CGM-SHH) içeren CGM besiyeri hazırlayın ve gerektiğinde 37 °C'ye dengeleyin.
- Glia hücresinin çıkarılması için RT'de 1-2 saat boyunca 100 μg / mL poli-D-lizin ile 6 oyuklu hücre kültürü plakalarını kaplayın. Daha sonra steril ddH2O ile iki kez yıkayın ve plakaları kurumaya bırakın. Plakaları 4 °C'de en fazla bir hafta saklayın.
- CGNP'lerin yetiştirilmesi için, 6 oyuklu hücre kültürü plakalarını gece boyunca 4 ° C'de poli-L-ornitin (0.1 mg / mL) ile kaplayın. Daha sonra, hücre kültürü için H2O ile iki kez yıkayın ve plakaların kurumasını bekleyin.
not: Plakalar 4 °C'de en fazla bir hafta saklanabilir.
- HBSS / Glikozda% 0.025 tripsin (a / h) hazırlayın ve gerektiğinde 37 ° C'ye dengeleyin.
- Beyin dokusunun nöral progenitör izolasyonu
- CGNP'lerin (serebellar granüler nöron progenitörleri) izolasyonu ve isteğe bağlı ekimi
- P5-7 hayvanlarını makas kullanarak dekapitasyon ile ötenazi yapın. Kafa derisini çıkarın, kafatasını açın ve küçük makas ve forseps kullanarak beyni çıkarın. Beyincik'i izole edin ve buz gibi soğuk HBSS / Glikoz'a aktarın. Tüm meninksleri ve kan damarlarını çıkarın ve serebellayı soğuk HBSS / Glikoz ile doldurulmuş 15 mL'lik tüplere aktarın.
- Beyinciğı 10 mL buz gibi HBSS/Glikoz ile üç kez yıkayın (bunları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleme ile toplayın) ve ardından serebellayı 1 mL'lik bir pipetle (maksimum 2-3 kez) hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin 0,5-1 mm3 parça elde etmek için.
- HBSS / Glikoza 5 mL% 0.025 tripsin ekleyin ve dokuyu 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca sürekli karıştırarak inkübe edin. 5 mL CGM ekleyerek sindirimi durdurun ve dokuyu 4 ° C'de 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Süpernatanı çıkarın ve dokuyu 1 mL CGM'de 1 mL'lik bir pipet ucuyla ezin ve 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
not: Hava kabarcıklarından kaçınmak önemlidir.
- 5 mL CGM ekleyin ve doku kalıntılarını çökeltmek için karışımı buz üzerinde 2 dakika inkübe edin. Süpernatanı 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Kalan dokuya 2 mL CGM ekleyin ve öğütme prosedürünü tekrarlayın.
- Süpernatanları bir araya getirin (doku kalıntıları olmadan, toplamda yaklaşık 10 mL) ve serebellar hücreleri toplamak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin. Peleti 10 mL CGM'de yeniden süspanse edin.
- Astrositler poli-D-lizine CGNP'lerden daha hızlı ve daha güçlü yapıştığından, hücreleri 100 μg / mL poli-D-lizin kaplı 6 oyuklu plaka (oyuk başına 4 mL'ye kadar) üzerine yerleştirin ve astrositleri çıkarmak için 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Plakayı sallayın ve süpernatanı toplayın. Daha sonra 15 mL'lik bir tüpte 4 ° C'de 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin. Peletleri 10 mL CGM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri bir Neubauer sayma odası ile sayın.
not: CGNP'ler yuvarlak, küçüktür ve faz kontrast mikroskobu kullanılarak görüntülendiğinde bir hale gösterir.
- Gerekirse, hücreleri poli-L-ornitin kaplı plakalar (6 oyuklu başına 3 x 106 hücre) üzerinde 37 ° C'de önceden ısıtılmış CGM'de tohumlayın ve bunları 37 ° C,% 5 CO2 ve% 100 bağıl nemde inkübe edin.
not: CGM'yi plakalarda (ve bununla birlikte FBS'de) bırakmak, CGNP'lerin serebellar granüler nöronlara (CGN'ler) farklılaşmasına neden olacaktır.
