1. Kortikal beyin organoid oluşumu (Şekil 1)
>NOT: Protokolün bu bölümündeki tüm adımlar, aksi belirtilmedikçe Sınıf 2 biyogüvenlik başlığında gerçekleşecektir.
- İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) 2D kültürden 2D nöroektodermal kolonilerin indüksiyonu (-1 ila 3. günler)
- İndüksiyondan önce, hPSC kolonilerini bir insan embriyonik kök hücresi (hESC) nitelikli bazal membran matrisi üzerine% 20 -% 30 yoğunlukta 6 oyuklu bir plakada kaplayın. Bu yoğunluğu, hPSC kolonilerini 6 oyuklu bir plakanın bir kuyusundan %60 birleşimde 6 oyuklu bir plakanın üç oyuğuna geçirerek elde edin.
- Bodrum membran matris kaplaması için, bazal membran matrisini düz bir bazal ortamda 1:50 oranında seyreltin. 6 oyuklu bir plakanın 1 mL / kuyusunu eşit şekilde biriktirin, oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin ve ardından aspire edin.
- Farklılaşmadan önce hPSC kolonilerini 2 mL serumsuz hücre kültürü ortamında 1 gün boyunca koruyun.
- hPSC farklılaşmasının olduğu gün, tespit edilebilir farklılaşma olmayan sağlıklı koloniler sağlamak için hPSC kolonilerini 4x ila 10x büyütmede parlak alan mikroskobu kullanarak inceleyin.
not: Sağlıklı hPSC'ler, büyük bir çekirdeğe, çok küçük sitoplazmaya ve belirgin nükleollere sahip hücrelerle sıkı kenar kolonileri oluşturacaktır. Farklılaşmış iPSC kolonileri, özellikle kolonilerin dış kenarları çevresinde veya merkezde, yukarıda açıklanan hPSC kolonilerininkinden belirgin morfolojik farklılıklar sergileyecektir.
- Farklılaşma için gereken N1 ortamını oluşturmak için Tablo 2'de listelenen reaktifleri ekleyin. Kullanmadan önce bu ortamı RT'ye getirin.
- RT'ye girdikten sonra, serum içermeyen hücre kültürü ortamını 6 oyuklu plakanın her bir oyuğundan aspire edin ve bunu 5 mL serolojik pipet ile nazikçe eklenen 2 mL N2 ortamı ile değiştirin.
- Dekapentaplejik (SMAD) inhibitörlere, SB-431542 (10 μM) ve LDN 193189'ye (100 nM) karşı Annelerin ikili Baskılayıcısını ekleyin.
not: SMAD inhibitörleri, ortam her bir oyuğa yerleştirildikten sonra N2 ortamına veya serumsuz hücre kültürü ortamının değiştirilmesinden önce gerekli miktarda N2 ortamına eklenebilir. İnhibitörler, plakayı hafifçe döndürerek veya ortamı ve inhibitörleri içeren tüpü 3-4 kez ters çevirerek ortama eşit şekilde dahil edilebilir.
- Önümüzdeki 2 gün boyunca her bir oyuğa günlük olarak SB-431542 (10 μM) ve LDN 193189 (100 nM) ile takviye edilmiş taze N2 ortamı ekleyin.
not: Hücrelerin SB-431542 ve LDN 193189 bileşiklerini çözmek ve sitotoksisiteyi önlemek için kullanılan Dimetil sülfoksite (DMSO) uzun süre maruz kalmasını azaltmak için taze N2 ortamı eklenir.
- İndüklenmiş 2D nöroektodermal kolonilerden 3D nöroektodermal sferoidlerin üretilmesi (3 ila 7. günler)
- 1.2.2-1.2.8 adımlarını izleyerek dispas kullanarak indüklenmiş nöroektodermal kolonileri kaldırın.
- İlk olarak, 6 oyuklu plakadan 2 mL N2 ortamını çıkarın ve N2 ortamının tamamının çıkarıldığından emin olmak için 1x'i HBSS ile yıkayın.
not: N2 ortamı, dispasın enzim aktivitesine müdahale ederek nöroektodermal kolonilerin kuyudan yeterince ayrılmasını önleyebilir.
- Koloni içeren her kuyucuğa 1 mL 2.4 birim / mL dispase ekleyin.
- Kuyuyu 37 ° C'de 20-25 dakika (maksimum 30 dakika) inkübe edin. Koloni ayrılmasını düzenli olarak kontrol edin.
not: Küçük koloniler 20 dakika içinde ayrılabilir. 30 dakika sonra sıkışıp kalan koloniler göz ardı edilmelidir.
- İnkübasyondan sonra, dispas enziminin aktivitesini durdurmak için kuyucuğa 1 mL N2 ortamı ekleyin ve kolonileri geniş delikli bir P1000 pipet ucu veya steril makasla kesilmiş modifiye edilmiş bir P1000 pipet ucu kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın (geniş delikli bir P1000 ucu yapar).
- Koloni kümelerinin yerçekimi ile tüpün dibine batmasına izin verin.
not: Bu işlem yaklaşık olarak 1 dakika sürecektir.
- Topaklar battıktan sonra, süpernatanı standart bir P1000 pipet ucuyla dikkatlice çıkarın ve 1 mL taze N2 ortamı ile değiştirin. Dispase.
tamamen çıkarılmasını sağlamak için bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
not: Kalan herhangi bir dispas, nöroektodermal sferoidlerin düzgün bir oluşumunu önleyecek ve hücre ölümünü indükleyecektir.
- Yıkandıktan sonra, hücre kümelerini 3 mL N2 ortamında yeniden süspanse edin, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın ve 40 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyin.
not: Çok sayıda nöroektodermal koloni ayrılırsa, bu koloniler, sferoidlerin füzyonunu önlemek için 6 oyuklu bir plakanın iki veya daha fazla oyuğuna kaplanabilir. Kolonilerin ayrılmasından 24 saat sonra, sferoidlerin oluşup oluşmadığını kontrol edin.
- Sferoidleri önümüzdeki 3-4 gün boyunca aynı ortamda tutun, ancak nöroektodermal hücre proliferasyonunu teşvik etmek, kendi kendini organize etmek ve nöroepiteliyi indüklemek ve genişletmek için her gün her kuyucuğa taze bFGF (40 ng / mL) ekleyin.
not: Sferoidler daha yüksek bir yoğunlukta kaplanmışsa, ortamın sararması muhtemeldir ve her 2 günde bir taze bFGF (40 ng / mL) ile değiştirilmesi gerekir. Bununla birlikte, bu önerilmez ve bunun yerine, bu sorunu önlemek için her kuyucukta daha az sayıda sferoid bulundurulmalıdır. Nöroepitel belirginse, sferoidler 3 gün sonra bazal membran matrisine gömülebilir. Nöroepitel belirgin değilse veya güçlü görünmüyorsa, sferoidleri bir gün daha koruyun ve tekrar kontrol edin.
Tablo 1: N2 Orta. Tablo, N2 ortamını hazırlamak için gereken reaktifleri listeler.
| Ortam bileşenleri | konsantrasyon |
| DMEM Besin karışımı F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | |
| N2 takviyesi 5 mL (100x) | %1 oranında desteklendi |
| B 27 Takviye 10 mL | % 2 oranında takviye edildi |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) | %1 oranında takviye edildi |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | %1 oranında takviye edildi |
| 2-Merkaptoetanol 50 mL (1000x) | %0,1 oranında takviye edilmiştir |
