$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Diseksiyon materyali, kültür ortamı, mikroakışkan cihazların hazırlanması
- Otoklav mikro diseksiyon forseps ve makasları (121 °C, sterilizasyon süresi: 20 dk) ve steril bir kapta saklayın.
- Cam lamelleri (24 mm x 24 mm) 37 °C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca 1 M HCl'de inkübe ederek sterilize edin. Steril, damıtılmış H2O ile üç kez ve% 99 etanol ile üç kez yıkayın. Daha sonra lamelleri 37 °C'de veya steril bir akış başlığı altında kurutun. Son olarak, sterilizasyonu tamamlamak için lamelleri otoklavlayın veya UV ışığına (30 dakika) maruz bırakın. Lameller daha sonra %70 etanol içinde saklanabilir.
- Steril forseps kullanarak AXIS Axon İzolasyon Cihazlarını paketinden dikkatlice çıkarın ve steril bir Petri kabına yerleştirin.
- Steril bir biyopsi zımbası (ø: 1mm) kullanarak, kültür odalarının uygunluğunda kültürlenecek numune başına bir delik oluşturun (Şekil 1).
not: Uygulanan basınçtan zarar görebilecekleri için mikro oluklara çok yakın delmeyin.
- AXIS Akson İzolasyon Cihazlarını %70 etanole batırarak sterilize edin. Ardından AXIS Axon İzolasyon Cihazlarını ve lamellerini steril bir akış başlığı altında tamamen kurutun. Devam etmeden önce en az 3 saat bekleyin.
not: Eksik kurutma, mikroakışkan cihazların hatalı montajına neden olacaktır.
- Her lameli 35 mm'lik bir Petri kabına veya 6 oyuklu bir plaka içindeki bir kuyuya yerleştirin.
- AXIS Axon İzolasyon Cihazını lamel üzerine yerleştirin ve izolasyon cihazı ile cam lamel arasında tam yapışma sağlamak için uçları bükülmüş forseps ile nazikçe ama sıkıca bastırın.
- Her kültür odasında, 150 μl poli-D-lizin (steril, damıtılmış H2O'da 0.1 mg / ml) pipetleyin. Kültür odalarındaki tüm havayı çıkarmak için mikroakışkan cihazları 5 dakika vakum altına koyun.
- Odaların içinde hala hava görülebiliyorsa, poli-D-lizin çözeltisini odalara yeniden pipetleyin.
- Cihazları poli-D-lizin O/N ile 37 °C'de inkübe edin.
- Hazneleri steril, damıtılmış H2O ile üç kez yıkayın.
- Odaları 150 μl laminin çalışma solüsyonu (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, fosfat tamponlu salin (PBS) veya serumsuz ortamda) doldurun ve O/N'yi 37 °C'de inkübe edin.
- Aşağıdaki bileşime sahip trigeminal gangliyon kültürleri için 50 ml ortam hazırlayın: 48 ml Nörobazal ortam, 1 ml B-27, 100 U/ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin, 5 ng / ml sinir büyüme faktörü (NGF), 0.25 pM sitozin arabinozit.
- Aşağıdaki bileşime sahip diş germ kültürleri için 50 ml besiyeri hazırlayın: 40 ml Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)-F12, 10 ml fetal sığır serumu (FBS, nihai konsantrasyon: %20), 100 U/ml penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 150 μg/ml askorbik asit.
2. Fare Embriyo Üretimi ve Diseksiyonu
- Vajinal tıkaca göre embriyonik yaşı belirleyin (vajinal tıkaç: embriyonik gelişim günü 0.5, E0.5) ve morfolojik kriterlerle onaylayın. Bu protokol için genellikle E14.5-E17.5 fare embriyolarını kullanıyoruz.
- Diseksiyon alanını ve stereoskopu% 70 etanol ile temizleyin.
- Hamile anneyi servikal çıkık yoluyla kurban edin. Farenin boynunu bir ızgara üzerinde birinci ve ikinci parmaklar arasına yerleştirin ve kuyruğu kararlı bir şekilde çekin.
- Alt karın çevresindeki cildi inceleyin ve makas kullanarak karnı açın. Rahmi bulun: Hamileliğin geç evrelerinde, rahim karın boşluğunu bol miktarda doldurur.
- Uterusu inceleyin ve buz üzerinde PBS ile doldurulmuş bir tüpe yerleştirin. Buz üzerindeyken, doku birkaç saat bırakılabilir. Annenin cesedini kurumsal yönergelere göre atın.
- Embriyoları uterustan ayırın ve ekstraembriyonik dokularından kurtarın. Embriyoları PBS'ye buz üzerine yerleştirin.
- Makas kullanarak embriyoların başını kesin ve mikro diseksiyon makası kullanarak alt çeneyi başın geri kalanından ayırın (Şekil 2A). Trigeminal gangliyonlara zarar vermeden alt çeneyi tam olarak çıkarın; Sonuncusu alt çeneye yakın bir yerde lokalize olduğundan, kazara hasar görmeleri mümkündür. Alt çeneyi ve başın geri kalanını buz üzerinde soğuk PBS'de koruyun.
- Trigeminal gangliyonları (TG) diseksiyon etmek için, kafayı alın ve daha önce soğuk PBS ile doldurulmuş bir diseksiyon camı Petri kabına yerleştirin. Forseps kullanarak cildi ve kafatasını çıkarın. Daha sonra telensefalonun altına forseps yerleştirerek telensefalonu ve beyinciği çıkarın ve kaldırın; Telensefalon ve beyincik birlikte dönecek ve kafatasının altını açıkta bırakacaktır.
- Trigeminal gangliyonları lokalize edin (Şekil 2B). TG'yi trigeminal sinirlerden ayırmak için forseps kullanın. Diseksiyon iğnelerini bıçak olarak kullanarak trigeminal çıkıntıların kalıntılarını ortadan kaldırın. Disseke edilmiş TG'yi soğuk PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
- Embriyonik dişleri incelemek için, daha önce kafatasından ayrılmış olan alt çeneyi, soğuk PBS ile doldurulmuş diseksiyon camı Petri kabına yerleştirin. Diseksiyon iğnelerini bıçak olarak kullanarak, dili ve çeneyi çevreleyen cildi çıkarın. Çenenin orta hattı boyunca keserek sol ve sağ yarım çeneleri ayırın. Diş mikropları, Şekil 2C'de gösterildiği gibi kolayca görülebilir. Diseksiyon iğneleri kullanarak diş mikroplarını izole edin ve fazla diş dışı dokuları çıkarın. Diseke edilmiş diş mikroplarını soğuk PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına koyun ve buz üzerinde tutun.
3. Mikroakışkan Ko-kültürler
- Diseksiyondan sonra, laminini mikroakışkan cihazlardan çıkarın. Odaları 200 μl ilgili ortamla doldurun.
- Forseps ile disseke edilmiş TG ve diş mikroplarını nazikçe delme ile oluşturulan deliklere aktarın (Şekil 2D). Diş mikroplarının yüzmediğinden ve lamellerle temas edene kadar battığından emin olun.
- Numuneleri bir inkübatörde 37 °C,% 5 CO2'de kültürleyin.
- Kültür ortamını her 48 saatte bir değiştirin. Hazneleri tamamen boşaltmayın ve doğrudan kültür haznelerine pipetlemeyin.
Odaların tamamen boşaltılması, odaların içinde hava kabarcıklarının oluşmasına neden olur; Hazneye doğrudan pipetleme aksonal hasara neden olur. Bu sorunları önlemek için, pipeti kuyucukların dış tarafına doğru işaret eden ortamı çıkarın; Benzer şekilde, taze ortamı, odaların karşısında bulunan kuyucukların yan tarafına pipetleyin.
- Ko-kültürler, kültür periyodu boyunca hızlandırılmış mikroskopi ile kolayca görüntülenebilir ve 10 günden fazla korunabilir.
- Kültür periyodundan sonra, hazne başına bir oyuğa 150 μl PBS pipetleyerek ve PBS'nin haznelerden üç kez akmasına izin vererek hazneleri yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve hazne başına bir oyukta 150 μl paraformaldehit% 4 (PBS cinsinden) pipetleyerek numuneleri sabitleyin; RT'de 15 dakika inkübe edin. Hazneleri 3.6'da açıklandığı gibi PBS ile iki kez yıkayın.
- Daha fazla analizle devam edin.
