$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>NOT: Şekil 1A, B, ana kanalların veya bölmelerin, kuyuların ve mikro olukların konumları dahil olmak üzere önceden monte edilmiş döngüsel olefin kopolimer (COC) çipinin bir şemasını göstermektedir. Bölümlere ayrılmış çip, gıda boyası boyasının izolasyonu ile gösterildiği gibi bir bölme içinde farklı akışkan mikro ortamlar oluşturabilir (Şekil 1C).
1. hSC nöronları için çok bölmeli çiplerin kaplanması
NOT: Şekil 2A, kaplama prosedürlerine genel bir bakış göstermektedir.
- 20 μg/mL'lik bir çalışma çözeltisinin çip başına 600 μL çözelti yapmak için poli-L-ornitini hücre kültürü dereceli damıtılmış suda çözün.
- Kuyulardan cipsleri hazırladıktan sonra kalan fosfat tamponlu salini (PBS) aspire edin. Aspirasyon yaparken, pipet ucunun kanal açıklığından uzakta olduğundan emin olun.
not: Mikroakışkan kanallar bu prosedürün tamamı boyunca dolu kalmalıdır. Kanallardan/bölmelerden sıvı aspire etmeyin, sadece kuyulardan aspire edin.
- Sağ üst kuyuya 150 μL poli-L-ornitin çalışma solüsyonu yükleyin. 90 saniye veya sıvı sağ alt kuyuyu doldurmaya başlayana kadar bekleyin. Sağ alt kuyucuğa 150 μL ortam ekleyin ve sıvının mikro oluklardan geçmesi için 5 dakika bekleyin.
- Sol üst kuyucuğa 150 μL ortam ekleyin. 90 saniye bekleyin ve ardından sol alt kuyucuğa 150 μL ekleyin. Çip(ler)in tutucusunu parafilm ile sarın ve gece boyunca 4 °C'de yerleştirin.
not: Alternatif olarak, çipi ve tutucuyu 1 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin.
- Pipet ucunun kanal açıklığından uzağa yerleştirildiğinden emin olarak ortamı kuyucuklardan aspire edin. Sağ üst kuyucuğa 150 μL steril su ekleyin. 90 saniye bekleyin ve ardından sağ alt kuyucuğa 150 μL ekleyin. Sıvının mikro oluklardan geçmesi için 5 dakika bekleyin.
- Sol üst kuyucuğa 150 μL steril su ekleyin, 90 saniye bekleyin ve ardından sol alt kuyucuğa 150 μL daha ekleyin.
- 1.5-1.6 adımlarını tekrarlayın.
- Laminini 2 °C ila 8 °C arasında yavaşça çözdürün ve 10 μg/mL'lik bir çalışma solüsyonu hazırlayın.
- Sağ üst kuyucuğa 150 μL laminin çalışma solüsyonu yükleyin. 90 saniye veya sıvı sağ alt kuyuyu doldurmaya başlayana kadar bekleyin. Sağ alt kuyucuğa 150 μL pipetleyin. Lamininin mikro oluklardan geçmesi için 5 dakika bekleyin.
- Sol üst kuyucuğa 150 μL laminin ekleyin. 90 saniye bekleyin ve ardından sol alt kuyucuğa 150 μL ekleyin. Çipi tutucusu içinde 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Çipi PBS ile durulayın (Ca2+ ve Mg2+ olmadan). Sağ üst kuyuya 150 μL PBS yükleyin. 90 saniye veya sıvı sağ alt kuyuyu doldurmaya başlayana kadar bekleyin. Sağ alt kuyucuğa 150 μL PBS ekleyin ve PBS'nin mikro oluklardan geçmesi için 5 dakika bekleyin.
- Sol üst kuyucuğa 150 μL PBS pipetleyin. 90 saniye sonra sol alt kuyucuğa 150 μL pipetleyin.
- Çipten PBS'yi aspire edin ve ardından çipi NSC ortamıyla durulayın (bkz. Malzeme Tablosu). Sağ üst kuyuya 150 μL ortam yükleyin. 90 saniye sonra veya sıvı sağ kanaldan sağ alt kuyuya geçtiğinde, sağ alt kuyucuğa 150 μL ekleyin. Ortamın mikro oluklardan akması için 5 dakika bekleyin.
- Sol üst kuyucuğa 150 μL ortam ve sol alt kuyucuğa 150 μL daha ekleyin. Çipi 37 °C'lik bir inkübatörde %5CO2 ile inkübe edin ve çipi tohumlamaya hazır olana kadar ön koşullandırın. NSC'ler.
not: Gerekirse cipsler gece boyunca önceden şartlandırılabilir.
2. NSC'lerin çok bölmeli çipe yerleştirilmesi
>NOT: Bu protokol, insan embriyonik kök hücreleriyle başlayan önceki yayınımızın aksine, ticari olarak satın alınan NSC'leri kullandı. Bu protokolde nöral kök hücreler doğrudan plastik çiplerin içine kaplanır ve burada nöronlara farklılaşırlar. Hücrelerin 2 geçişe kadar NSC'ler (farklılaşma olmaksızın) olarak çoğalmasına izin verilebilir ve daha fazla kullanım için sıvı N2 içindeki şişelerde saklanabilir. Bu protokol, geçiş 1 veya 2'den sonra sıvı N2'de saklanan NSC şişelerini kullanır. Şekil 2B, kaplama prosedürlerine genel bir bakışı göstermektedir.
- NSC'leri üreticinin talimatlarına göre çözdürün.
not: Bu prosedür H9'dan türetilen NSC'ler için geçerlidir. Diğer hücre hatları, hücre yoğunluğu optimizasyonu gerektirecektir.
- Bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu sayın ve mL başına 7 x 106 hücrelik bir konsantrasyon elde etmek için NSC ortamını kullanarak ayarlayın.
- Çipin her bir kuyusundan ortamı aspire edin. Ana kanallardan ortam aspire etmekten kaçının.
- Hücre çözeltisinin 5 μL'sini sağ üst kuyucuğa, ardından 5 μL'yi sağ alt kuyucuğa pipetleyin (toplam 70.000 hücre). Hücrelerin ana kanal açıklıklarına doğru pipetlendiğinden emin olun. Hücrelerin kanala girip girmediğini kontrol etmek için bir mikroskop kullanın. Hücrelerin çipin altına yapışması için 5 dakika bekleyin.
not: Hücreleri yüklemek için bölmelerden biri veya her ikisi de kullanılabilir.
- Sağ üst kuyucuğa ~ 150 μL NSC ortamı pipetleyin ve ardından sağ alt kuyucuğa 150 μL pipetleyin. Sol tarafta tekrarlayın. Uygun bir nemlendirilmiş kap içinde% 5 CO2, 37 ° C'de inkübe edin.
- 48 saat sonra, kuyucuklardan NSC ortamını aspire edin ve her bir üst oyuğa ve her bir alt oyuğa 150 μL ekleyerek nöral farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- Uygun bir nemlendirilmiş kap içinde% 5 CO2, 37 ° C inkübatör içinde kültür nöronları.
