$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Çözeltilerin Hazırlanması
- Papain (100 U/ml), sistein (0.2 mg/ml) ve deoksiribonükleaz (DNaz, 250 U/ml) içeren steril fenol kırmızısı içeren Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininden (DPBS) yapılan doku ayrışma solüsyonu hazırlayın.
- DNaz çözeltisini hazırlamak için, 100 mg liyofilize DNaz I tozunu (bir şişe) 50 mL H2O içinde seyreltin, İyice karıştırın ve stok çözeltisini süzün. 10 mL stok alikotları hazırlayın. Bir stok tüpünü 0,5 mL tek kullanımlık alikotlara bölün. Bu tek kullanımlık alikotları -80 °C'de saklayın.
- Manyetik kolon tamponu X:% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi hazırlayarak manyetik ayırma reaktifleri hazırlayın.
- Nörosfer ortamı hazırlamak için, L-glutamin içeren penisilin / streptomisin içeren bir nörobazal ortam kullanın ve% 2 B27, 20 ng / mL insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng / mL insan rekombinant temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile takviye edin.
- Farklılaşma ortamı hazırlamak için bir nörobazal ortam kullanın ve 10 ng/mL farklılaşmış faktör trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA) veya 10 ng/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve %2 B27 ile destekleyin.
- Ultra düşük ataşman 12 kuyulu (3,5cm2) ve 6 oyuklu (9,6cm2) kültür plakaları kullanın.
2. Beyincik Diseksiyonu
- Fare yavrularını (P3-P7) izofluran ile uyuşturun ve cerrahi makas kullanarak kafalarını ayırın.
- Yavruların ayrılmış kafalarına %70 etanol püskürtün.
- Her kafayı 10 cm'lik boş bir steril kültür kabına aktarın. Mikrodiseksiyon makası kullanarak cildi ayırın, ardından makası orta hat boyunca sagital olarak hareket ettirerek kafatasını çıkarın.
- # 7 forseps kullanarak, beyin sapından kaudal olarak başlayarak kafatası kemiklerini soyun. Beyni bir spatula kullanarak dikkatlice kaldırın, beyinciği sağlam tutun ve beyni 15 mL buz gibi Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS) çözeltisi içeren 10,0 cm'lik taze steril bir tabağa aktarın.
- Beyni içeren çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. İnce # 5 forseps kullanarak, meninksleri ve büyük kan damarlarını beyincikten çıkarın ve spatula kullanarak beyinciği beyin sapından ayırın.
- Beyinciği, 5.0 mL buz gibi soğuk HBSS çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Beyinciği, 5.0 mL HBSS.
ile 3 kez durulayıp boşaltarak yıkayın
not: Her beyincik, daha sonraki işlemler için kendi tüpüne yerleştirilmelidir.
3. Hücre Süspansiyonu Hazırlama
- Beyni içeren çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. İnce # 5 forseps kullanarak, meninksleri ve büyük kan damarlarını beyincikten çıkarın ve spatula kullanarak beyinciği beyin sapından ayırın.
- Beyinciği, 5.0 mL buz gibi soğuk HBSS çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Beyinciği, 5.0 mL HBSS.
ile 3 kez durulayıp boşaltarak yıkayın
not: Her beyincik, daha sonraki işlemler için kendi tüpüne yerleştirilmelidir.
- Son durulamadan sonra, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış 5 mL papain bazlı doku ayrışma solüsyonu ekleyin. Dokuyu bir su banyosunda 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Tüpü her 3 dakikada bir 3x-5x yukarı ve aşağı çevirerek, bir somunlama karıştırıcısı kullanarak veya elle içeriği yavaşça karıştırın.
- Daha önce açıklandığı gibi geniş çaplı (normal cam pipet) ve dar çaplı Pasteur pipeti (bir Bunsen brülörü üzerinde ısıtılarak ateşle parlatılmış) hazırlayın.
- Dokuyu 3 kez 5 mL HBSS solüsyonu ile yıkayın, böylece elle boşaltırken doku kaybını önleyin.
- Son HBSS yıkamasını çıkarın ve dokuya 250 μL DNaz çözeltisi içeren 5 mL DPBS çözeltisi ekleyin. Geniş çaplı Pasteur pipetini kullanarak 10x-15x ezme yaparak dokuyu ayırın. Kabarcık oluşumunu önlemek için bu adımı nazikçe gerçekleştirin.
- Daha sonra bulamacı su banyosunda 37 ° C'de 10 dakika daha inkübe edin, tüpü ters çevirerek ve düzleştirerek karıştırın.
- Doku bulamacını 10 kat daha fazla ezmek için küçültülmüş çaplı Pasteur pipetini kullanın. Büyük doku parçaları kalırsa, doku parçalarını pipetin ucuyla tüpün dibine hafifçe bastırın ve hücreler ince bir süspansiyona ulaşana kadar pipetlemeye devam edin.
- Dokuyu 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin ve önceki karıştırma adımlarını tekrarlayın.
4. Kök Hücrelerin İmmün Etiketlemesi
- Santrifüj tüplerini buzun üzerine yerleştirin ve sonraki adımlar için buz gibi soğuk solüsyonlar kullanın. Ayrışan hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Bu ek solüsyonda hücrelerin ağdan geçmesini sağlamak için filtreyi 10.0 mL HBSS solüsyonu ile doldurun.
- Filtrelenmiş hücreleri 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu 300 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Bir vakum aspiratörü kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın.
- Peleti 160 μL manyetik kolon tamponunda yeniden süspanse edin. Manyetik etiketlemeden önce tek hücreli süspansiyonu elde etmek için, aksi takdirde sütunu tıkayabilecek hücre kümelerini çıkarmak için hücreleri 30 μm'lik bir naylon ağdan geçirin.
- Her 15 mL'lik tüpe 40 μL anti-prominin-1 mikroboncuk ekleyin, karıştırın ve antikorun prominin-1 eksprese eden hücrelere bağlanması için buzdolabında 15 dakika inkübe edin.
- 1.0-2.0 mL kolon tamponu X ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
- Peletleri 1.0 mL sütun tamponu X.
içinde yeniden süspanse edin
not: Peletin 1.0 mL kolon tamponu X ile yeniden süspansiyonundan sonra küçük topaklar görülürse, bunlar Pasteur pipetinin ucu kullanılarak dikkatlice çıkarılmalıdır, aksi takdirde bu kümeler hücre sıralaması sırasında manyetik kolonu tıkayabilir.
5. Manyetik Kolon Hazırlama, Hücre Sıralama ve Kaplama
>NOT: Farklı genotip koşullarından (hastalık ve kontrol) manyetik ayırma aynı anda yapılmalıdır, çünkü herhangi bir gecikme nörosfer morfolojisini etkileyebilir.
- Manyetik kolonları, manyetik alana maruz kalan manyetik stand üzerine yerleştirerek hazırlayın. Atılacak bir santrifüj tüpüne damlayan tamponu uygulayarak sütunu 500 μL tampon X ile bir kez durulayın.
not: Her deney için yeni manyetik sütun tamponu X hazırlayın; Aksi takdirde kök hücre verimi düşük olacaktır.
- Etiketli hücre askıya alma işlemini sütuna uygulayın. Esas olarak serebellar nöronal / glial karışık hücrelerden oluşan etiketlenmemiş hücreler içeren akışı taze 15 mL'lik tüplerde toplayın (Şekil 1A).
- Kolonu 3x'i 500 μL tampon X ile yıkayın (her yıkama yaklaşık 2-4 dakika sürer).
not: Serebellar granüler nöronlarla zenginleştirilmiş serebellar nöronal/glial karışık kültür, bu saflaştırma adımının yararlı bir yan ürünü olarak hizmet edebilir.
- Sütunu manyetik alandan çıkarın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Kolona 1.0 mL kültür ortamı (nörosfer ortamı) ekleyin ve prominin-1 boncukları ile etiketlenmiş hücreleri taze bir 1.5 mL şahin tüpüne boşaltmak için pistonu kolonun içine itin.
- Prominin-1 etiketli hücrelerin saflığını arttırmak için, 5.1-5.4 adımlarını izleyerek ayrıştırılmış hücreleri ikinci bir sütundan geçirin.
- Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Tipik verim, beyincik başına 10:7 hücredir. Hücreleri ultra düşük bağlantı plakalarına (aşağı akış deneyleri için gereken yoğunluğa bağlı olarak 6 veya 12 oyuklu) yerleştirin.
6. Nörosferlerin Geçişi ve Farklılaşması
- Prominin-1 etiketli kök hücreleri, nörosfer ortamında (5.000 hücre / kuyu) ultra düşük bağlantılı 12 oyuklu plakalar üzerine yerleştirin.
- 7-10 gün sonra, hücreler bölünerek top şeklinde yüzen nörosferler (birincil nörosferler) oluşturur.
not: Bu deneyde, daha fazla kullanım için sayıca genişleyen ikincil nörosferler üretilir. Birincil nörosfer popülasyonları bu deneyler için kullanılmaz, çünkü kök hücre özelliklerine sahip olmayan ve nörosferlerle birlikte kümelenebilen kirletici hücreler içerebilirler.
- Geçiş için, 1.0 mL pipet uçları kullanarak birincil nöroküreleri kültür ortamı ile birlikte 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın. Nörosferleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı atın.
- Pelet, papain veya% 0.05 tripsin çözeltisi içeren 5 mL doku ayrışma ortamında yeniden süspanse edin. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 5 mL nörosfer ortamında yeniden süspanse edin ve plastik bir Pasteur pipeti kullanarak hücreleri mekanik olarak ayırın ve yavaşça 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Hücreleri (tekrar) daha önce tarif edildiği gibi nörosfer ortamında plakalayın. Kültürde 7-10 gün sonra, plaka ikincil nörokürelerle zenginleştirilmelidir.
not: Bu kültürler iyi bir verimlilikle 8x'e kadar geçirilebilir, bundan sonra nörosfer boyutu daha küçük olma eğilimindedir ve proliferasyonda bir azalma olduğunu düşündürür.
- Hemositometre üzerindeki hücreleri sayın ve poli-D-lizin kaplı plakalar (6 veya 12 kuyucuk) üzerinde gelecekteki deneyler için en uygun sayıyı plakalayın.
- Kök hücreleri ayırt etmek için, pelete bir farklılaşma ortamı eklemek dışında, daha önce tarif edildiği gibi santrifüjleme yoluyla ikinci ila sekizinci geçişten nöroküreler toplayın.
not: 7 gün sonra in vitro olarak, kök hücreler, nöronal belirteç β-III tübülin, astrositik belirteç Glial fibriler asidik protein (GFAP) ve oligodendrosit belirteci O4 ile boyanarak gösterildiği gibi nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaşır.
