Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Kılıfı Glia ile Kokültürasyonu

Özet

Kaynak: Portela-Lomba, M., et al. Aksotomize Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Kılıfı Glia ile Kokültürü, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun İn Vitro Modeli Olarak. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, bir sıçanın retinasından retinal ganglion nöronlarını (RGN'ler) izole etme ve bunları koku alma kılıflayıcı glia (OEG) hücreleriyle birlikte kültürleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, nöral yaralanma sonrası OEG'lerin nöro-rejeneratif potansiyelinin incelenmesine izin verir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Test için ihOEG'nin (Ts12 ve Ts14) hazırlanması

>NOT: Bu adım, RGN diseksiyonu ve kokültürden 24 saat önce yapılmalıdır.

1. 12 mm Ø lamelleri 1 h.
   için 10 μg / mL poli-L-lizin (PLL) ile tedavi edin not: Lameller gece boyunca PLL çözeltisinde bırakılabilir.
2. Lamelleri 1x fosfat tampon salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
3. Ts12 ve Ts14 ihOEG hücrelerini p60 hücre kültürü kabından ayırın.
   1. 15 mL'lik konik bir tüpe 4 mL DMEM / F12 (bazal ortam)-FBS (fetal sığır serumu) kültür ortamı ekleyin. Temiz su banyosunda 37 °C'de ısıtın.
   2. Ortamı plakalardan çıkarın ve hücreleri bir kez 1 mL 1x PBS (fosfat tamponlu salin)-EDTA (etilen diamin tetraasetik asit) ile yıkayın.
   3. OEG hücrelerine 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 3-5 dakika inkübe edin.
   4. Hücreleri bir p1000 pipeti ile toplayın ve bunları adım 2.1'de hazırlanan ortama aktarın.
   5. 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   6. Süpernatanı arzulayın.
   7. 1 mL ME10 ortamı ekleyin ve peleti yeniden süspanse edin.
   8. Bir hemositometredeki hücre sayısını sayın.
4. 80.000 Ts14 hücresi veya 100.000 Ts12 hücresi / kuyusu, 500 μL ME10 ortamında 24 oyuklu plakalardaki lamellerin üzerine tohumlayın.
5. 24 saat boyunca% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de kültür hücreleri.

2. Retina dokusu diseksiyonu

>NOT: RGN kaynağı olarak 2 aylık erkek Wistar sıçanları kullanılmıştır. 24 oyuklu bir hücre çanağının 20 oyuğu için iki retina (bir sıçan). Kullanmadan önce cerrahi malzemeyi otoklavlayın. Papain ayrışma kiti ticari olarak satın alınır (Malzeme Tablosu). Sulandırma için sağlayıcının talimatlarını izleyin. D, L-2-amino-5-fosfonovalerik asidi (APV) 5 mM stokta sulandırın ve alikotları hazırlayın.

1. Tahlil gününde, aşağıdaki ortamı hazırlayın.
   1. 5 mL soğuk EBSS (Earle'ün dengeli tuz çözeltisi) (papain ayrışma kitinin 1. şişesi) içeren bir p60 hücre kültürü kabı hazırlayın.
   2. Sulandırılmış flakon 2 (papain) papain ayrışma kiti artı 50 μL APV içeren bir p60 hücre kültürü kabı hazırlayın. Ardından, 250 μL sulandırılmış flakon 3 (DNaz artı 5 μL APV) ekleyin.
   3. Steril bir tüpte, 2.7 mL flakon 1'i 300 μL flakon 4 (albümin-ovomokoid proteaz inhibitörü) ile karıştırın. 150 μL flakon 3 (DNaz) artı 30 μL APV ekleyin.
   4. 20 mL Nörobazal-B27 ortamı (NB-B27) hazırlayın.
2. CO₂ ile boğularak bir sıçan kurban edin.
3. Bir giyotin ile kafayı keserek kafayı çıkarın; 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve laminer akış başlığına yerleştirmeden önce kafaya% 70 etanol püskürtün.
4. Farenin bıyıklarını makasla kesin, böylece göz manipülasyonuna müdahale etmezler.
5. Bir neşter ile göz boyunca bir kesi yapabilecek kadar göz küresini dışarı çekmek için optik siniri forseps ile kavrayın.
6. Lensi ve vitreus mizahını çıkarın ve gözün geri kalan katmanları (pigment epitel tabakası dahil) içeride kalırken retinayı (turuncu benzeri doku) dışarı çekin.
7. Retinayı adım 2.1.1'de hazırlanan p60 hücre kültürü kabına yerleştirin.
8. Retinayı adım 2.1.2'de hazırlanan p60 hücre kültürü kabına aktarın ve neşter ile yaklaşık 1 mm boyutunda küçük parçalar
9. 15 mL'lik bir plastik tüpe aktarın.
10. Dokuyu 30 dakika boyunca, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ altında, her 10 dakikada bir çalkalama ile inkübe edin.
11. Bir cam Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kümelerini ayırın.
12. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
13. Süpernatanı atın. Papaini inaktive etmek için, adım 2.1.3'te hazırlanan çözeltideki hücre peletini yeniden süspanse edin (2 göz için 1.5 mL).
14. Bu hücre süspansiyonunu 5 mL sulandırılmış şişeye 4 dikkatlice pipetleyin.
15. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
16. Santrifüjleme sırasında, ME-10 ortamını OEG 24 kuyulu hücre plakasından (daha önce adım 1'de hazırlanmıştı) tamamen çıkarın ve oyuk başına 500 μL NB-B27 ortamı ile değiştirin.
17. Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL NB-B27 ortamında yeniden süspanse edin.
18. M24 plakasının oyuğu başına 100 μL retina hücre süspansiyonu, PLL ile muamele edilmiş veya OEG tek katmanlı lameller üzerine plaka.
19. Kültürleri NB-B27 ortamında 96 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
B-27 Takviyesi	Gibco (Gibco)	17504044
D, L-2-amino-5-fosfonovalerik asit	Sigma	283967	NMDA reseptör inhibitörü
DMEM-F12	Gibco (Gibco)	11320033	Hücre kültürü ortamı
FBS (FBS)	Gibco (Gibco)	11573397	Fetal sığır serumu
FBS-Hidroklon	Balıkçı Bilimsel	16291082	Fetal sığır serumu
L-Glutamin	Fransa	BE17-605F
Nörobazal Orta	Gibco (Gibco)	21103049	Nöronal hücre kültürü ortamı
Papain Ayrışma Sistemi	Worthington Biyokimya Şirketi	LK003150	Nöral hücre izolasyonunda kullanım için
Pbs	Ev yapımı
PBS-EDTA (Türkçe-Doğum Makinesi)	Fransa	H3BE02-017F
Penisilin / Streptomisin / Amfoterisin B	Fransa	17-745D	Bakteriyostatik ve bakterisidal
Hipofiz özü	Gibco (Gibco)	13028014	Sığır hipofiz özü
Poli -L-lizin (PLL)	Sigma	A-003-M

Serisi