Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hücre Dışı Matriks Jel Lekeleri
- İzolasyondan bir gün önce aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
- Hücre dışı matris jelinin (100 μl) bir kısmını 4 ° C'de en az 1.5 saat boyunca çözdürün. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında 1:10 oranında seyreltin; 4.500 mg / L glikoz, 4 mM L-glutamin ve 110 mg / ml sodyum piruvat (DMEM) ile. Hücre dışı matris jeli her zaman 4 °C'de tutun.
NOT: Ani sıcaklık değişiklikleri, eşit olmayan kaplamaya ve kristal oluşumuna neden olur.
- Seyreltilmiş hücre dışı matris jel çözeltisini 15 dakika buz üzerinde tutun.
- 20 μl'lik bir mikropipeti 10 dakika önceden soğutun.
- 8 oyuklu hazneli kızakları 100 mm'lik bir Petri kabına koyun ve kabı 10 dakika boyunca soğuk bir yüzeye (örneğin bir dondurucu paketi) aktarın.
- Her oyuğa bir damla 10 μl hücre dışı matris jeli koymak için önceden soğutulmuş mikropipeti kullanın. Petri kabını en az 7 dakika daha soğuk yüzeyde tutun (Şekil 1A).
- Kalan hücre dışı matris jeli tamamen çıkarın (Şekil 1B) ve kuyuları gece boyunca 37 °C'de kurutun.
2. Kafa Kaslarının Diseksiyonu (Masseter, Digastric ve Levator Veli Palatini)
- Diseksiyondan önce,% 2 Penisilin-Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş 50 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Buz üzerinde tutun.
- CO2 / O2 ile genç bir yetişkin sıçanın (9 hafta) ötenazisinden sonra, başın başını kesin ve cildi kafadan çıkarın. Kafayı 50 ml'lik bir tüpte %2 P/S ile desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.
- Masseter kası (1. branşial arktan türetilmiştir)
- Kafayı bir tarafı yukarı bakacak şekilde silikon bir pedin üzerine yerleştirin ve hipodermik iğnelerle sabitleyin (Şekil 2A).
- Parotis bezini ve fasiyal siniri tanımlayın (Şekil 2A). Bezi kaplayan derin fasyayı ortaya çıkarın. Fasyayı kesin ve diseksiyon makası kullanarak bezi çıkarın. Dış kulak kanalını tanımlayın. Fasiyal siniri stilomastoid foramenden takip edin ve temporal, elmacık ve bukkal dalları 15 numaralı bir neşter bıçağı ile dikkatlice çıkarın.
- Fasyayı çıkararak masseter kasının yüzeysel başını serbest bırakın. Masseter kasının hem yüzeysel hem de derin başlarını tanımlayın. Yüzeysel kafayı, kalın tendinöz aponevrozu maksillanın elmacık sürecine yerleştirilene kadar izleyin.
- Düz forseps ile elmacık sürecinde tendonu kökeninden ayırın. 15 numaralı neşter bıçağı veya diseksiyon makası ile kesin ve dikkatlice kaldırın (Şekil 2B).
- Masseterin yüzeysel başını, mandibula ramusunun yan yüzeyinin açısına ve alt yarısına 15 numaralı bir neşter bıçağı ile yerleştirilene kadar inceleyin (Şekil 2C). Şimdi, kası tamamen çıkarın.
- Digastrik kasın arka göbeği (2. branşial arktan türetilmiştir)
- Başı silikon ped üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve hipodermik iğnelerle sabitleyin (Şekil 3A).
- Hem dil altı hem de submandibular bezlerin üzerindeki deri altı yağını çıkarın. Ardından, diseksiyon makası kullanarak yüzeysel fasyayı ve bezleri çıkarın. Digastrik kası ortaya çıkarın (ön ve arka göbek).
- Arka göbeğin ön tendonunu düz forseps ile tutun, kesin ve kökeni timpanik bülle olana kadar dikkatlice inceleyin (Şekil 3B). Karşı tarafta da aynısını yapın.
- Levator veli palatini kası (4. branş kemerinden türetilmiştir)
- Digastrik kasın arka göbeğinin diseksiyonundan sonra, stilohyoid kası lokalize edin, lateral olarak çekin ve dikkatlice çıkarın (Şekil 4A).
- Timpanik bülle üzerine giren levator veli palatini'nin tendonunu lokalize edin (Şekil 4A). Dikkatlice inceleyin ve her iki taraftan kesin.
- Trakea ve arkasından geçen yemek borusunu arayın. Yemek borusunu kaldırın ve farenks ve gırtlağı ortaya çıkarın.
- Superior faringeal konstriktör kasının alanını lokalize edin ve inceleyin. Levator veli palatini'yi tanımlayın ve her iki tarafından kesin (Şekil 4B).
not: Diseksiyondan hemen sonra, stereo mikroskop altında her kastan tendon ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Tüm numuneleri hızlı bir şekilde %70 etanole batırın ve 15 ml'lik bir tüpte %2 P/S ile desteklenmiş buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.
3. Uydu Hücrelerinin (SC'ler) İzolasyonu
- Üç kas grubundan SC izolasyonu için aşağıdaki hazırlık adımlarını gerçekleştirin:
- DMEM'de 7.5 ml% 0.1 pronaz hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtreden süzün. İzolasyondan önce çözeltiyi 37 °C'de bir su banyosunda 10 dakika önceden ısıtın.
- % 10 At Serumu (HS) ve% 1 P / S ile desteklenmiş 35 ml DMEM hazırlayın. Ayrıca, bir su banyosunda 37 °C'de önceden ısıtın.
- % 20 fetal sığır serumu (FBS),% 10 HS,% 1 P / S ve% 1 tavuk embriyosu özü (CEE) ile desteklenmiş DMEM'den oluşan 15 ml kültür ortamı hazırlayın. Bir su banyosunda 37 °C'de önceden ısıtın.
- Altı plastik pipeti (10 ml) HS ile önceden kaplayın ve kullanmadan önce en az 10 dakika kurulayın.
- Kültür davlumbazında, her kası 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Diseksiyon makasını kullanarak kası yaklaşık 2 mm'lik küçük parçalar halinde kesin. Dokuyu çok fazla kıymamaya dikkat edin.
- Her bir oyuğa dikkatlice 2,5 ml% 0,1 pronaz çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin. 20, 40 ve 60 dakika sonra plakayı hafifçe sallayın.
not: Kuluçka süresinin tam olarak ne kadar uzun olduğu, hayvanların yaşı ve türü gibi faktörlere bağlıdır.
- Mikroskop altında izleyin. Kas parçalarını kontrol edin ve lif demetleri gevşemiş göründüğünde enzimatik sindirimi durdurun (Şekil 5).
- % 10 HS ve% 1 P / S ile desteklenmiş 2.5 ml DMEM ekleyin. 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve tüpleri 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
- % 10 HS ve% 1 P / S ile desteklenmiş 5 ml DMEM ekleyin. Dokuyu homojenize etmek için çözeltiyi 10 ml'lik bir plastik pipetle (öğütme) en az 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Tüpleri 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve 15 ml'lik bir tüpe aktarın.
- % 10 HS ve% 1 P / S ile desteklenmiş 5 ml DMEM ekleyin. Doku parçaları kolayca geçene kadar 10 ml'lik plastik bir pipet ile tekrar pipetleyin.
- Tüpleri 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 15 ml'lik bir tüpte toplayın.
- 50 ml'lik bir tüpe bir hücre süzgeci (40 μm) koyun ve ayrışmış hücreleri içeren süpernatanı filtreye aktarın. Maksimum hücre geri kazanımı için 1 ml DMEM ile yıkayın.
- Tüpleri 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipetle atın.
- Peleti 300 μl kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometrede sayın.
4. Hücre Dışı Matriks Jel Noktalarında Uydu Hücrelerinin Farklılaşması
- 10 μl kültür ortamında 1.5 x 103 hücre elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin.
- Hazne kızaklarının kapaklarını bantla sabitleyin ve noktaları nesne camının alt tarafında siyah bir işaretleyici ile işaretleyin.
- Bir mikropipet kullanarak, hücre dışı matris jel noktasına 10 μl'lik bir damla hücre süspansiyonu koyun. Mikroskop altında, hücre süspansiyonu damlasının yerinde doğru şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin. 37 °C'de altı saat inkübe edin.
- Dikkatlice 400 μl kültür ortamı ekleyin (% 20 FBS,% 10 HS,% 1 P / S ve% 1 CEE ile desteklenmiş DMEM) ve 37 ° C'de üç gün inkübe edin< br / >
not: Bu noktada, yeni izole edilmiş SK'ler büyük travmaya (enzimatik sindirim ve sert öğütme) maruz kalır ve iyileşmeleri gerekir. İlk üç gün boyunca hücreleri rahatsız etmeyin. Daha sonra, kültür ortamı deneyin türüne bağlı olarak değiştirilebilir.
Hücre dışı matris jel lekeleri, farklılaşma testi için yüksek hücre yoğunluğu (1.5-2.5 x 103/20 μl) ile tohumlanabilir. Kültür ortamı (% 20 FBS,% 10 HS,% 1 P / S ve% 1 tavuk embriyosu özü ile desteklenmiş DMEM) her üç günde bir değiştirilebilir.
