Fare Embriyonik Karsinom Hücreleri kullanılarak Retinoik Asit Kaynaklı Nörogenez

Özet

Kaynak: Leszczyński, P., et al., P19 Embriyonal Karsinom Hücrelerini Kullanarak Nörogenez J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, P19 fare embriyonik karsinomu hücrelerinde retinoik asit kaynaklı nörojenez için basit bir tekniği göstermektedir. Retinoik asit, transkripsiyon faktörlerini aktive eder ve nöronal farklılaşma için gen ekspresyonunu tetikler.

Protokol

1. Toplam Üretim

1. 10 mL Farklılaşma Ortamına 5 μL RA (retinoik asit) (% 99.8 etanol içinde çözülmüş 1 mM stok, -20 ° C'de saklanır) ekleyin ve iyice karıştırın (son konsantrasyon 0.5 μM RA).
   not: RA ışığa duyarlıdır. Düşük bir etanol konsantrasyonu hücre farklılaşmasını etkilemez.
2. 100 mm'lik işlenmemiş kültür kabına (süspansiyon kültürüne adanmış) 10 mL Farklılaşma Ortamı (RA ile) ekleyin.
3. 100 mm'lik tabağa 1 x^{10 6} hücreyi tohumlayın (Tabak yüzey alanı 56,5 cm2).
4. Agrega oluşumunu teşvik etmek için hücreli şişeyi 2 gün boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübatöre koyun.
5. 2 gün sonra Farklılaştırma Ortamını değiştirin. 10 mL'lik bir pipet kullanarak agrega içeren besiyerini aspire edin ve RT'de 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
6. Agregaların RT'de 1,5 dakika yerçekimi ile çökelmesine izin verin.
7. Süpernatanı atın.
8. 10 mL serolojik pipet kullanarak 0,5 μM RA ile 10 mL taze bir Farklılaşma Ortamı ekleyin.
   Dikkat: Hücre agregalarını yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
9. Agregaları 100 mm'lik yeni bir işlenmemiş kültür kabına (süspansiyon kültürüne adanmış) tohumlayın.
10. Plakayı 2 gün boyunca inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO_2'de) yerleştirin.

2. Agregalar Ayrışma

1. Hücre agregalarını 10 mL'lik bir pipet kullanarak aspire edin.
2. Agregaları 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre agregalarının yerçekimi ile 1,5 dakika çökmesine izin verin.
3. Süpernatanı çıkarın.
4. Agregaları sadece DMEM ile yıkayın (serum ve antibiyotik içermez).
5. Hücre agregalarının RT'de 1.5 dakika boyunca yerçekimi sedimantasyonu ile çökelmesine izin verin.
6. Süpernatanı aspire edin ve 2 mL tripsin-EDTA (% 0.25) ekleyin.
7. Hücre agregalarını 10 dakika boyunca bir su banyosuna (37 °C) koyun. Agregaları her 2 dakikada bir elinizle hafifçe vurarak çalkalayın.
8. 4 mL Bakım Ortamı ekleyerek tripsinizasyon işlemini durdurun.
9. Agregaları 1 mL'lik bir pipet kullanarak 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
10. Hücreleri 200 x g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin.
11. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 5 mL Bakım Ortamında yeniden süspanse edin.
12. Hücre sayacı ile hücre numarasını belirleyin.

3. Kaplama Hücreleri

1. 6 oyuklu bir plakaya Bakım Ortamı kuyusu başına 3 mL ekleyin.
2. 6 oyuklu kültür plakasındaki tohum hücreleri 0.5 x 10⁶/oyuk.
3. % 5 CO₂ konsantrasyonu ile 37 ° C'de inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
L-glutamin ile DMEM yüksek glikoz (4.5 g / L)	Fransa	BE12-604Q
Etanol %99,8	Chempur Belediyesi	KIMYA*613964202
Fetal Sığır Serumu (FBS)	EUR	E5050-03
Penisilin / Streptomisin 10K / 10K	Fransa	DE17-602E
Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum Fizyolojik (PBS), 1x kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan konsantre	Fransa	BE17- 517Q
Retinoik asit	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	% 99.8 etanol içinde çözülür; -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın
Tripsin% 0.25 - HBSS'de EDTA, kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan, Fenol Kırmızısı ile	Biyosera	LM-T1720/500
1 mL Serolojik Pipetler	Profil Oluşturma	515,01
10 mL Serolojik Pipetler	Profil Oluşturma	515,1
Süspansiyon kültürü için ayrılmış 100 mm'lik çanak	Corning	C351029
15 mL santrifüj tüpleri	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL Serolojik Pipetler	Profil Oluşturma	515,05
6 oyuklu plaka	Corning	CLS3516
Hücre kültürü şişeleri, yüzey alanı 25 cm kare	Sigma- Aldrich	CLS430639-200 EA

Serisi Serisi Serisi