$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fare Embriyonik Fibroblastlarının (MEF'ler) Kültürü
- % 15 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM, yüksek glikoz) olan MEF ortamını hazırlayın.
- 100 mm hücre kültürü kaplarını oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca% 0.5 jelatin çözeltisi ile kaplayın.
- Bir sitometre kullanarak MEF'leri sayın. Jelatin çözeltisini çıkarın ve hemen 37 ° C'ye önceden ısıtılmış MEF ortamını dökün. Mitomisin C ile muamele edilmiş MEF şişelerini 37 ° C'lik bir su banyosunda 2 dakika boyunca hızla çözün, ardından 100 mm jelatin kaplı tabak başına 2,8 x10 6 MEF tohumlayın. Başka boyutlarda bulaşıklar kullanıyorsanız hücre numarasını buna göre ayarlayın. MEF'leri gece boyunca 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin.
- Ertesi gün ortamı değiştirin. MEF tabakası birleşene kadar 2-3 gün kültür.
2. Fare Embriyonik kök hücre veya ESC Kültürü
- % 15 FBS ve% 103 U / mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 55 mM 2-merkaptoetanol, penisilin (100 U / mL), streptomisin (100 μg / mL), gentamisin (200 μg / mL) ve% 0.2 mikoplazma antibiyotik ile desteklenmiş ESC ortamı, Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) hazırlayın.
- 1. adımda hazırlanan tabaktan MEF ortamını çıkarın ve 37 °C önceden ısıtılmış ESC ortamı ile değiştirin.
- MEF tabakasının üstüne bir ESC şişesi ve tohum hücrelerinin buzunu çözün. ESC'ler birleşene kadar 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
- Birleşen bir tek tabaka MEF içeren yeni hücre kültürü kapları hazırlayın. ESC'leri geçmek için PBS ile bir kez yıkayın ve 37 ° C,% 5 CO2'de 2-5 dakika boyunca% 0.25 tripsin / EDTA ile ayırın. Ayırma hücrelerine% 15 FBS ile taze IMDM ekleyerek tripsinizasyonu durdurun, hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 160 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın, ESC'leri taze IMDM ile yeniden süspanse edin ve hücrelerin beşte birini her yeni MEF kaplı tabağa geçirin; hücreler birleşene kadar (tipik olarak 4-5 gün) inkübe edin.
>3. Jelatin Kaplı Plakalar Üzerindeki MEF'leri ve Kültür ESC'lerini Geri Çekin
- ECS'ler birleşime ulaştığında, bunları ve MEF'leri adım 2.4'teki gibi% 0.25 Tripsin / EDTA ile ayırın, hücreleri taze IMDM'de yeniden süspanse edin, yapışkan olmayan bir bakteriyolojik petri kabına aktarın ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 40 dakika inkübe edin.
- ESC'leri ve MEF içeren ortamı, tekrarlanan pipetlemeyi önleyerek 5 mL'lik bir pipet kullanarak yeni bir jelatin kaplı plakaya dikkatlice aktarın. Petri kaplarında kalan hücreler, ESC'ler yapışmadığı için MEF'lerdir.
- ESC'leri her 3-4 günde bir geçin. Daha az sıklıkta geçiş ESC pluripotentliğini azaltabilir. Farklılaşmayı destekleyebileceğinden% 60 birleşmeyi aşmayın.
- MEF'lerin mevcut olmadığından emin olmak için, MEF'ler artık bir hücre kültürü mikroskobu tarafından tespit edilemeyecek duruma gelene kadar 3.2-3.3 adımlarını gerektiği gibi üç kez veya daha fazla tekrarlayın, 20X objektif kullanarak.
- Hücrelerin tipik ESC poligonal morfolojisine sahip yoğun koloniler oluşturup oluşturmadığını görmek için ESC kültürünü kontrol ederek ESC pluripotensini doğrulayın (Şekil 1A). Kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), immünoblotlama veya çekirdek pluripotens transkripsiyon faktörlerinin immünofloresan ile hücre sapını test edin (Şekil 2).
4. EB Oluşumu
- DMSO'da 10 mM'de bir all-trans-RA stok çözeltisi hazırlayın ve bunu 1.5 mL ışık korumalı mikrofüj tüplerine ayırın. Çözelti -80 °C'de iki haftaya kadar stabildir. Işıktan koruyun.
- ESC'leri adım 2.4'teki gibi tripsinize edin; tek hücreli bir süspansiyon olarak LIF olmadan taze IMDM'de yeniden plakalayın.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 0.5 μM RA ile IMDM'de 5 x 105 hücre / mL süspansiyon hazırlayın.
- 8 kanallı pipet ve 200 μL uç ile 100 mm'lik petri kabı başına 100 20 μL'lik damla tabağı, bulaşıkları ters çevirin ve asılı damlaların kurumasını önlemek için ters çevrilmiş kapağı PBS ile doldurun. RA içeren kültür ortamını ışıktan koruyun.
- Asılı kalan kültür EB'leri 4 gün boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2'de düşer.
