1. 2K7 Lentivector'un Klonlanması
- İlgilenilen geni 2K7 lentiviral vektörüne klonlamadan önce, standart moleküler teknikler kullanarak geni pENTR vektörüne (3637 bp, Kanamisin dirençli) alt klonlayın. Alt klonlama için EcoRI ve SacII kısıtlama sitelerini kullanın.
- 2K7 Lentivector'un Amplifikasyonu
- 100 ng plazmit DNA'yı yetkin hücrelerle nazikçe karıştırarak 2K7 lentivektör DNA'yı dönüştürün ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Isı şoku DNA'sı / yetkin hücreler 42 ° C'de 90 saniye boyunca karışır ve bunları hem ampisilin (100 μg / ml) hem de kloramfenikol (15 μg / ml) içeren LB-Agar plakaları üzerine 37 ° C'de 16-18 >NOT: Kloramfenikol, uzun terminal tekrarları arasındaki rekombinasyonu önlemek için kullanılır.
- Ertesi gün, seçilmiş bakteri klonlarını hem ampisilin (100 μg/ml) hem de kloramfenikol (15 μg/ml) içeren Luria-Bertani (LB) ortamında 37 ° C'de 16-18 saat büyütün. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir plazmid DNA Maxiprep kiti kullanarak DNA'yı çıkarın.
- pENTR vektöründen 2K7 Lentivector'a alt klonlama (Şekil 1).
- 1,5 ml'lik bir tüpe aşağıdakileri ekleyin ve hafifçe karıştırın: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotör) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (ilgilenilen gen ile) (80 bng)1-2,5 μl K7 lentivektör (80 ng/μl)1 μl TE-tamponu, pH 82-5 μl.Toplam 8 μl.
- Klonaz enzim karışımını -80 °C'den çıkarın ve 2 dakika buz üzerinde çözdürün. Bu enzimin -80 °C'den itibaren taze bir alikot olduğundan emin olun, çünkü enzim tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ile klonlama verimliliğini önemli ölçüde azaltmıştır
- Reaksiyon başına 2 μl enzim ekleyin ve girdap yoluyla iyice karıştırın ve klonaz reaksiyon karışımını 23-25 ° C'de 6-24 saat inkübe edin.
- Klonaz reaksiyon karışımına 1 μl proteinaz K çözeltisi (enzim kiti ile birlikte verilir) ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Klonaz reaksiyon karışımını yetkin hücrelere dönüştürün ve seçilen kolonileri ampisilin (100 μg/ml) içeren LB ortamında 37 °C'de 16-18 saat büyütün.
- Üreticinin talimatlarına göre ticari bir plazmid DNA Miniprep kiti kullanarak DNA'yı ekstrakte edin ve saflaştırın.
- Kısıtlama enzimleri Spe I ve Sac II kullanarak DNA'yı sindirim yoluyla onaylayın ve promotörü ve ilgilenilen geni içeren parçayı çıkarmak için üreticinin talimatına göre uygun bir tampon.
NOT: Bu adım, alt klonlanmış DNA'nın doğru vektör omurgası ile ilgilenilen doğru ek genine sahip olup olmadığını kontrol etmek için kritik öneme sahiptir. Eklenen parça olmadan vektörün kendisinin boyutu 6,7 kb'dir. Serbest bırakılan eklenen parçanın boyutu, hem promotörü hem de ilgilenilen ekleme genini içerir. Bir DNA dizisi düzenleme programı, örneğin APE-A Plazmid Editörü aracılığıyla spesifik gen için sindirimden beklenen parça boyutlarını hesaplayın.
- 100 V'ta 1x TAE tamponunda (Tablo 1'e bakınız) %1'lik bir agaroz jeli çalıştırarak hem DNA vektör omurgasının hem de salınan parçanın boyutlarını kontrol edin.
- Ampisilin (100 μg/ml) içeren 500 ml LB ortamında 37 ° C'de 16-18 saat boyunca bakteri büyüterek doğrulanmış DNA'yı çoğaltın.
- Üreticinin talimatlarına göre ticari bir plazmid DNA Maxiprep kiti kullanarak DNA'yı ekstrakte edin ve saflaştırın.
not: Maxiprep tipik olarak viral üretim için gerekli olan yeterli miktarda DNA üretir.
- Lentiviral preparatlar için aşağıdaki DNA'ları çoğaltmak için 1.3.9-1.3.10 adımlarını tekrarlayın: Zarf vektörü (PMD2. G, 6.1 kb), Paket vektörü (pBR8.91, 12.5 kb) ve kontrol olarak boş bir lentiviral vektör (GFP-CMV-2K7, 8.7 kb).
2. 2K7 Virüs Üretimi
NOT: 1. Gün:
- Transfeksiyon gününde, 25 ml İnsan Embriyonik Böbreği (HEK) 293 T hücre ortamı içeren bir T175 şişesine 32 milyon HEK293 T hücresi yerleştirin (bakınız Tablo 1). Alternatif olarak, transfeksiyon gününde zaman kısıtlıysa, transfeksiyondan bir gün önce 16 milyon hücre plakalayın.
not: Transfeksiyon, transfeksiyon gününde veya günden önce hücreleri kaplayarak eşit derecede başarılı olabilir. İki alternatiften herhangi birini kullanarak, buradaki kritik nokta, transfeksiyondan önce hücrelerin kültür kabı yüzeyine yapıştığından emin olmaktır.
not: 2. Gün:
- Transfeksiyon
- Transfeksiyondan önce, deiyonize suda 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 içeren Tris-etilendiamintetraasetik asit (TE) Tamponunda DNA'yı 1 μg/μl'ye seyreltin.
- 50 ml'lik bir tüpte, T2 şişesinde transfeksiyon için bir ana karışım (Tablo 175) hazırlayın. Önceden ısıtılmış Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM) DNA ekleyin ve girdapla iyice karıştırın, ardından steril polietilenimin (PEI) ekleyin (erken yağışı önlemek için Tablo 1'e bakınız.
- Tüpü 3-4x ters çevirerek iyice karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
- HEK293T hücrelerinde tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin. Kültür ortamını hücrelerden tamamen aspire edin ve önceden ısıtılmış HEK293T hücre kültürü ortamı (T175 şişesi başına 25 ml) ile besleyin.
- Transfeksiyon karışımını (DNA / PEI karışımı) tek katmanlı hücrelere damla damla ekleyin. İyice karıştırmak için nazikçe hareket edin ve transfekte edilmiş hücreleri gece boyunca 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin.
NOT: 3. Gün:
- Transfeksiyonun başarılı olduğundan emin olmak için, transfeksiyondan 24 saat sonra floresan mikroskobu ile yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonunu kontrol edin.
not: GFP eksprese eden hücrelerin %50'den fazlası tipik olarak iyi bir transfeksiyonu gösterir.
not: 4. Gün:
- Transfeksiyondan 48 saat sonra, viral süpernatanı toplayın ve taze HEK293 T ortamı (T175 şişesi başına 25 ml) ile değiştirin.
- Süpernatanttaki hücre kalıntılarını temizlemek için viral süpernatanı 1.140 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Temizlenmiş süpernatanı 50 ml'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: 5. Gün:
- Transfeksiyondan 72 saat sonra, ikinci viral süpernatan grubunu toplayın. Adım 2.3.1'i tekrarlayın ve havuz 48 ve 72 saat temizlenmiş süpernatantlar.
- Virüsü konsantre etmek için, 30 ml ultrasantrifüj tüpleri kullanarak 4 ° C'de 90 dakika boyunca 170.000 x g'da viral süpernatanı santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve temizlenen tüm süpernatan santrifüjlenene kadar adım 2.6'yı tekrarlayın ve tüpün tabanında (görünmez) bir virüs peleti artı çökelmiş PEI bırakın.
- Virüsü yeniden süspanse etmek için, ultrasantrifüj tüplerine 500 μl SATO ortamı (bkz. Tablo 1) ekleyin. 30 saniye boyunca girdap yapın ve virüsü mekanik olarak gevşetmek için tüpün tabanını bir pipet ucuyla kazıyın. Viral peleti kaybetmek için bu adımı 6 kez tekrarlayın.
- Yeniden süspanse edilmiş virüsü mikrosantrifüj tüplerine koyun ve çözünmeyen PEI'yi çıkarmak için çok kısa bir süre döndürün. Proteinleri uzaklaştırmak için süpernatanı 0.45 μm'lik bir filtreden süzün.
- Virüsü 20 μl, 50 μl ve 100 μl alikotlara ayırın ve -80 ° C'de saklayın.
3. OPC'lerin Dönüştürülmesi
- Siliyer nörotrofik faktör (CNTF, 10 ng/ml), Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF, 10 ng/ml), Nörotrofin 3 (NT3, 1 ng/ml) ve forskolin (4.2 μg/ml) ile SATO ortamında (10ml/10cm plaka) kültür primer OPC'leri 37 °C'de, diseksiyondan sonra 24 saat boyunca% 8 CO2
.
- OPC kültür ortamını tamamen aspire edin ve hücreleri büyüme faktörleri içeren taze yapılmış SATO ortamı (10 ml) ile besleyin (yukarıda adım 3.1'e bakın).
- OPC'lere optimal konsantrasyona virüs ekleyin, OPC'leri 48 saat daha kültürleyin.
>4. Miyelinasyon Ko-kültürleri için OPC Tohumlaması (Şekil 2)
- OPC'leri yüzeyden çıkarmak için, önce OPC plakalarını 8 ml Earle'nin dengeli tuz çözeltisi (EBSS) ile iki kez durulayın, ardından hücreleri 5 ml ılık% 0.05 Tripsin-EDTA ile EBSS ile 1:10 oranında seyreltilmiş 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin.
- Tripsini EBSS'de (5 ml) %30 FBS ile nötralize edin ve pipetleme ile hücreleri plakadan çıkarın. Hücre süspansiyonunu 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 15 dakika boyunca 180 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 ml önceden ısıtılmış SATO ortamında yeniden süspanse edin ve ardından hücre sayımı yapın.
- OPC tohumlamadan önce, ortamı DRG kültür plakasından tamamen aspire edin. 200.000 OPC'yi daha önce tarif edildiği gibi DRG nöronlarına damla damla nazikçe tohumlayın.
not: Toplam OPC tohumlama hacmi, 22 mm lamel başına 200 μl'den az olmalıdır.
- Doku kültürü başlığında plakayı 10 dakika hareket ettirmeden hücreleri oturmaya bırakın, ardından oyuk başına 1 ml önceden ısıtılmış SATO ortamı ile nazikçe doldurun.
- Kalan kardeş OPC'leri büyüme faktörlerine sahip SATO ortamı ile yeniden plakalayın (bkz. adım 6.1). İlgilenilen proteinin ekspresyonunu doğrulamak için bu kardeş OPC'leri kullanın.
- 24 saat sonra, SATO ortamını SATO ortamı (faktör yok) ve nörobazal (v / v)% 1 B2 içeren ko-kültür ortamı (2 ml / kuyucuk) ile değiştirin
.
- Western blot analizi ile miyelin protein ekspresyonu için ko-kültürleri değerlendirin ve miyelin bazik protein belirteçlerine ve nöronal belirteçlere karşı antikorlarla çift immün boyama yoluyla miyelinli aksonal segmentlerin oluşumunu görselleştirin.
