$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Floresan Etiketli Fare Nöronlarının Manuel Olarak Sınıflandırılması
- Aşağıdaki ayarlara sahip bir kılcal çektirme kullanarak cam mikro kılcal damarları (Malzeme Tablosuna bakın) 10–15 μm çıkış çapına çekin: ısı: 508, çekme: boş, vel: boş, zaman: boş.
- 120–150 cm esnek silikon boruyu (~ 0.8 mm iç çap) 0.2 μm poliviniliden diflorür (PVDF) membran şırınga filtresine ve uygun boru konektörleri kullanarak iki bir boru valfine takın.
- 500 mL soğutulmuş (4 ° C) yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF, Tablo 1) hazırlayın ve 15 dakika boyunca veya çözelti tamamen temizlenene kadar% 5 karbondioksit dengeli oksijeni bir hava taşından köpürterek oksijenlendirin.
- 150 mL'lik bir beherde bir aktivite bloker kokteyli ile 100 mL ACSF hazırlayın (Tablo 1).
- 150 mL'lik bir beherde 1 mg / mL Streptococcus fraksiyon IV proteaz ile 100 mL ACSF hazırlayın (Tablo 1).
- 150 mL'lik bir beherde% 1 fetal sığır serumu (FBS) çözeltisi ile 100 mL ACSF hazırlayın ve bir hava taşı ile% 5 karbondioksit dengeli oksijen ile oksijenlendirin.
- Kafatasını küçük bir makasla açarak ve kortekse zarar vermeden ince forseps kullanarak taze beyni çıkararak ötenazi yapılmış bir farenin beynini inceleyin.
not: Herhangi bir tür, yaş ve cinsiyetteki fareler istenildiği gibi kullanılabilir. Virüs veya diğer tehlikeli / bulaşıcı ajanlar enjekte edilen fareler üzerinde beyni dondurmayın veya manuel sıralama yapmayın.
- Beyni soğutulmuş ve oksijenli ACSF'de tutun ve tüm kesit süresi boyunca% 5 karbondioksit dengesi oksijenine bağlı bir hava taşı bırakın.
- Beyni vibratom aynasının üzerine yerleştirin ve koronal veya sagital bölümleri 300 μm kalınlığında kesin. Birkaç yüz hücreye kadar en az ~ 10-50 etiketli hücre elde etmek için gerektiği kadar çok bölüm toplayın. Dilimleri, oksijenli ACSF'de yıkanmaları için bir beherin içine yerleştirilmiş pamuklu gözenekli bir dilim tutucuya koyun.
- Taze dilimleri aktivite engelleyicili ACSF içeren bir behere aktarın ve oda sıcaklığında 15-20 dakika bloke edin. Hava taşı kullanarak oksijeni köpürtmeye devam edin.
- Oda sıcaklığında hafif sindirim sağlamak için dilimleri proteaz solüsyonu ile ACSF içeren bir behere taşıyın: P4-14 hayvanları için 20-30 dakika veya P28-56 hayvanları için 45-60 dakikaya kadar. Oksijen köpürmeye devam edin.
- Dilimleri oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca aktivite bloker solüsyonu ile ACSF içeren behere geri hareket ettirerek ACSF'yi proteaz ile yıkayın. Oksijen köpürmeye devam edin.
- Ayrı bölümleri, oda sıcaklığında %1 FBS içeren ACSF içeren 100 mm'lik bir Petri kabına taşıyın. Floresan diseksiyon kapsamı altında, en az 10-50 hücreye (birkaç yüze kadar) sahip mikrodiseksiyon alanları ve ilgi katmanları. Mikrodiseksiyonu bir çift ince forseps ile veya 22-28 G enjeksiyon iğnelerini tahta tutuculara (şişler) takarak gerçekleştirin.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak, mikrodiseke parçaları ACSF çözeltisinde ~ 0.8 mL% 1 FBS içeren 2 mL'lik bir mikrofüj tüpüne taşıyın.
- Diseke edilen dokuyu mikrofüj tüpünde oda sıcaklığında tritura edin. Açık alev üzerinde yuvarlayarak çıkış çapları azalan üç adet uzun saplı Pasteur pipeti yapın. Her pipetle en büyüğünden başlayıp en küçüğüyle bitecek şekilde ~10 vuruş gerçekleştirin.
- Ayrışmış hücreleri oksijenli ACSF içeren 100 mm'lik bir Petri kabına dağıtın (Petri kabı, istenirse 5 mm% 1 agar veya 1:10 oranında berrak silikon bileşiği ile ince bir şekilde kaplanabilir). Oda sıcaklığında saklayın.
- Hücrelerin yavaş yavaş yerleşmesi için ~ 5-7 dakika bekleyin, ardından GFP / RFP sinyalini diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin.
not: Tek hücreler, döküntüler ve küçük kümeler parlak alanda (BF) görünür olacaktır.
- Esnek silikon boruya (0,4-0,8 mm iç çap) bağlı bir kılcal pipet (adım 1.1'den itibaren) kullanarak bir seferde 10-15 GFP/RFP hücresi seçin ve hücreleri taze oksijenli ACSF içeren 100 mm'lik bir Petri kabına dağıtın.
- Boru valfinin ucunu dil ile bloke ederek, kılcal damarı ilgilenilen hücreye yakın konumlandırın. Tıkanıklığı giderdikten sonra kılcal hareket kullanarak hücreleri yakalayın ve fazla sıvının pipete girmesini önlemek için hızla tekrar bloke edin. Hücreleri, diseksiyon mikroskobunun floresan optiği altında kılcal ucu gözlemlerken, hafifçe üfleyerek taze oksijenli ACSF'li 100 mm'lik bir Petri kabına dağıtın. Toplamda ~ 100-150 hücre toplamayı hedefleyin.
- Adım 1.19'u bir veya iki kez daha tekrarlayın (döküntüye bağlı olarak) ve toplam ~50-75 hücreyi yeni bir 100 mm Petri kabına aktarın, böylece parlak alan diferansiyel girişim kontrastı (DIC) optiklerinde döküntü gibi kirleticilerin minimum düzeyde olduğundan emin olun.
Tablo 1: Çözeltilerin ve tamponların listesi.
| arabellek | madde | konsantrasyon | Miktar (μL) |
| Örnek Toplama tamponu | Rekombinant ribonükleaz inhibitörü | | 55 |
| Rcc | 1:50K seyreltilmiş | 110 |
| Nükleaz içermeyen su | | 605 |
| 16 tüpe (8'li 2 şerit; 200 μL PCR tüpü) 43.75 μL'lik bir miktar ekleyin; tüp başına aşağıdakileri ekleyin |
| UMI-primerler (ör. N10B1-N10B16) | 1 ng/μL | 6.25 μL/tüp |
| Her tüpte nihai hacim 50 μL (her tüp 25 μL'lik alikotlara bölünebilir ve -80 °C'de dondurulabilir) |
| Çözümleri: | madde | konsantrasyon | miktar |
| BOS: 5 L'yi çözündürmek için | NaCl (Doğal) | 126 milyon | 36.8 gr |
| Kartal | 3 milyon | 1.15 gr |
| NaH2PO4 | 1,25 milyon | 0.75 gr |
| NaHCO3 | 20 milyon | 8.4 gr |
| 500 mL ACSF'ye 10-15 dakika oksijen püskürtün ve her seferinde aşağıdakileri taze olarak ekleyin: |
| D-glikoz | 20 milyon | 1.8 gr |
| MgSO4 | 2 milyon | 4 M stoktan 0,5 mL |
| CaCl2 | 2 milyon | 4 M stoktan 0,5 mL |
| ACSF'yi baştan sona oksijenli tutun |
| Çözümleri: | madde | Konsantrasyon |
| Aktivite engelleyici kokteyl: 100x stok yapın |
| 100 mL ACSF'ye ekleyin | | |
| APV (Nükleer Yatırım) | 0,05 mM | |
| CNQX (Türkçe) | 0,02 milyon | |
| TTX (Türkçe) | 0.0001 mM (0.1 μM) |
| Çözümleri: | madde | miktar | |
| Proteaz izolasyonu (100 mL) | Streptomyces griseus'tan proteaz | 100 mg | |
| Fetal sığır serumu: ticari kaynak, her kullanım için 500 μL'de alikot. |